胃泌素釋放肽受體拮抗劑在小鼠肝缺血再灌注損傷中的保護作用.pdf

1、研究目的：
　　肝缺血再灌注(ischemia and reperfusion，I/R)損傷是肝移植，肝切除手術(shù)，創(chuàng)傷，失血性休克和心肺復蘇等臨床常見并發(fā)癥，嚴重影響患者的預后。然而，肝I/R損傷的內(nèi)在分子機制尚未完全明確，目前研究證據(jù)表明，當發(fā)生肝I/R損傷時，復雜的內(nèi)在因素，例如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，趨化因子和炎性細胞因子，導致中性粒細胞浸潤、炎癥反應與肝細胞損傷。但目前用于防止肝I

2、/R損傷的治療策略并不是最優(yōu)化的。
　　胃泌素釋放肽(gastrin-releasing peptide，GRP)是一種活性神經(jīng)肽，與其受體胃泌素釋放肽受體(gastrin-releasing peptide receptor，GRPR)相互作用后可促進細胞生長，參與免疫功能調(diào)節(jié)等多種生物學功能，已有研究表明GRP-GRPR在膿毒癥、膽囊炎等炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，通過阻斷GRP-GRPR反應可以抑制炎癥發(fā)展，改善免疫功能失常狀

3、態(tài)。
　　那么，GRP-GRPR在小鼠肝I/R模型中發(fā)揮何種作用，阻斷GRP與GRPR反應能否改善肝I/R損傷尚未見報道。因此，本研究擬建立部分肝缺血再灌注損傷小鼠模型，觀察GRP和GRPR在小鼠肝臟中的表達情況;探索GRPR拮抗劑RC-3095對小鼠肝I/R損傷的保護作用，并探索其可能的作用機制。
　　研究方法：
　　1、將C57BL/6小鼠按照再灌注時間隨機分為假手術(shù)組(sham，n=6)和I/R3h組(3h，n=

4、6)、I/R6h組(6h，n=6)、I/R12h組(12h，n=6)、I/R24h組(24h，n=6)，I/R組小鼠建立70％肝組織I/R損傷模型，缺血時間均為60min; sham組小鼠僅剖腹探查，并不做肝門部血管結(jié)扎處理。在缺血60min，再灌注3h，6h，12h和24h不同時間點時，各組小鼠于七氟醚麻醉下心臟穿刺采血，并獲取缺血部分肝臟組織，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,

5、 ELISA)法測定小鼠血清和肝組織中GRP的表達水平;蛋白質(zhì)免疫印記法(Western-blotting，WB)測定肝臟組織中GRPR蛋白的表達水平。
　　2、將C57BL/6小鼠隨機分為三組:假手術(shù)組（sham，n=6）、I/R組(I/R，n=6)以及RC-3095組(RC-3095，n=6)。缺血60min時，RC-3095組小鼠予以皮下注射RC-3095(3 mg/kg，150μl)，sham組及I/R組小鼠皮下注射同等體

6、積生理鹽水。注射后進行再灌注，6h后，七氟烷麻醉下心臟穿刺采血處死，并獲取各組小鼠缺血部分肝臟組織，①生化檢測儀測定血清AST、ALT濃度;②H&E染色后評估肝組織形態(tài)學改變;③檢測肝臟髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，評估肝組織氧化應激和中性粒細胞浸潤程度;④ELISA檢測細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平;⑤采用TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labe

7、ling)法檢測缺血肝細胞凋亡情況。
　　3、另取32只C57BL/6小鼠，分組情況同2，再灌注時間為6h，12h，24h，七氟烷麻醉下心臟穿刺采血處死小鼠后，肝組織經(jīng)勻漿、蛋白定量后，WB法檢測核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)活化和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase，JNK)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein

8、 kinases，ERK)、p38-MAPK(mitogen-activated protein kinase，MAPK)磷酸化水平。
　　研究結(jié)果：
　　1、GRP和GRPR表達:肝臟缺血60min，再灌注3h，小鼠肝組織中GRP便升高且達到峰值，持續(xù)到再灌注后6h（P＜0.01），隨后逐漸降低，但12h和24h時與sham組仍存在顯著差異;血清中，GRP3h時也顯著升高，6h達到峰值(P＜0.01)，隨后開始下降，12h

9、和24h時與sham組并無顯著差異;肝組織GRPR在再灌注3h時表達上調(diào)，6h后也達到峰值（P＜0.05），隨后開始降低，12h和24h表達與Sham組小鼠并無統(tǒng)計學差異。
　　2、RC-3095干預后，與I/R組相比較，RC-3095組小鼠肝損傷改變?nèi)缦?血清AST、ALT顯著降低(P＜0.01);H&E染色顯示肝臟細胞腫脹減輕，炎癥反應降低，中性粒細胞浸潤減少(P＜0.01);TUNEL染色顯示肝細胞凋亡明顯減少(P＜0.01

10、);MPO酶活性顯著減弱(P＜0.01);血清和缺血肝臟組織中TNF-α、IL-6和IL-1β表達水平下調(diào)(P＜0.01)，IL-10無改變，提示RC-3095改善了肝I/R后肝臟的損傷和炎癥反應。
　　3、GRP-GRPR參與肝臟I/R損傷的機制探討顯示:RC-3095組小鼠肝臟NF-κB活性比I/R組減弱，并JNK、ERK、p38磷酸化水平降低(P＜0.01）。
　　研究結(jié)論：
　　1、GRP-GRPR在小鼠肝I/