以Vif降解hA3G為靶點(diǎn)的抗HIV-1藥物篩選模型應(yīng)用.pdf

1、APOBEC3G(hA3G)是在人的淋巴細(xì)胞中表達(dá)的一種RNA/DNA編輯酶，可以高效抑制HIV—1的復(fù)制，因此成為宿主細(xì)胞固有的HIV—1病毒限制因子。HIV—1病毒編碼的Vif蛋白(viral infectivity factor)可以特異性地結(jié)合hA3G，通過(guò)泛素介導(dǎo)的降解途徑[3]，導(dǎo)致hA3G的降解，從而阻斷了宿主細(xì)胞hA3G對(duì)HIV—1病毒復(fù)制的抑制作用。鑒于HIV—1主要的靶細(xì)胞均表達(dá)hA3G，阻斷Vif介導(dǎo)的hA3G的降

2、解途徑成為一個(gè)極具潛力的抗HIV—1病毒的新靶點(diǎn)。
　　 本研究建立和優(yōu)化了以Vif對(duì)hA3G的降解作用為靶點(diǎn)，生物熒光為檢測(cè)手段的抗HIV—1藥物篩選模型。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)、Western blot等分析方法發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性化合物MG312可以顯著上調(diào)細(xì)胞中熒光水平及融合蛋白hA3G—YFP表達(dá)水平，驗(yàn)證了該模型可以用來(lái)篩選阻斷Vif對(duì)hA3G降解作用的活性化合物。同時(shí)，根據(jù)腺病毒E4orf6降解P53的機(jī)制建立了一個(gè)用來(lái)排除蛋白酶體降

3、解通路阻斷劑的復(fù)篩模型。
　　 隨后本上作應(yīng)用該初篩模型從化合物庫(kù)、微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物庫(kù)篩選可以阻斷Vif降解hA3G的活性物質(zhì)。對(duì)本所重點(diǎn)室化合物庫(kù)中的3100個(gè)化合物的初篩中，得到8個(gè)陽(yáng)性化合物。同時(shí)完成對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物庫(kù)中7300個(gè)發(fā)酵液的樣品的篩選，獲得64株剛性菌株，其中有8株有非常好的抗病毒活性。根據(jù)這些陽(yáng)性菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性、模型活性、抗病毒活性以及活性的可重復(fù)性，選擇I06A—02348作為陽(yáng)性發(fā)酵菌株，對(duì)其發(fā)

4、酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行探索性的分離純化，以期得到有臨床應(yīng)用前景的新的化合物。目前已從此發(fā)酵液中得到一些組分，在Vif—hA3G細(xì)胞篩選模型上顯出很好的活性。
　　 為進(jìn)一步優(yōu)化藥物篩選模型，本課題應(yīng)用了IRES(Internal ribosome entry site)艤蛋白表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)Vif和融合蛋白hA3G—YFP的真核表達(dá)載體，建立了穩(wěn)定表達(dá)雙蛋白的細(xì)胞系，以取代現(xiàn)行的瞬時(shí)表達(dá)篩選模型。目前該質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建成功