含白斑綜合癥美麗ie1啟動子的表達載體的構建與應用研究.pdf

1、白斑病對對蝦水產養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失,其病原為白斑綜合癥病毒(white spotsyndrome virus,WSSV)。在侵染宿主的過程中,其囊膜蛋白VP28起著關鍵作用。有報道重組表達的VP28或表達VP28的質粒具有明顯的抗病毒作用;而囊膜蛋白VP19在有些研究中表明其有抗病毒作用,也有的研究顯示其無抗病毒作用。為了深入了研究VP28的抗病毒功能,尋找一種有效地防治方法,并確定VP19的功能,我們構建了分別含WSSV的ie1啟動子

2、和VP19或VP28的表達載體(pIevp28,pIevp28)。將載體分別注射克氏原螯蝦后,通過實時定量PCR和蛋白質印跡等方法發(fā)現(xiàn)不同的質粒載體可以持續(xù)表達VP19或VP28,自第五天開始可以檢測到較強的信號并持續(xù)至第三十天,同時在遭遇病毒的侵染之后,與對照組相比注射VP28質粒的螯蝦感染病毒后死亡率明顯下降,并且病毒在體內的復制被抑制。而VP19質粒雖然能夠在螯蝦體內轉錄,但不能抑制病毒的復制,死亡率與對照組亦無明顯差異。免疫組織

3、化學的結果顯示VP28蛋白可以與血細胞的細胞膜結合,而VPl9則不能。根據(jù)上述結果,我們認為VP28可能是能通過競爭性抑制的作用對螯蝦進行保護。飼喂含有該質粒的大腸桿菌(E.coli)同樣可以降低螯蝦的死亡率。這或許可以作為一種新的防治白斑病毒的方法加以應用。
　　 而后我們考慮到該質粒是否可以用來表達螯蝦蛋白以研究其功能,于是選擇了來自克氏原螯蝦的一種C-型凝集素來進行實驗。C-型凝集素作為一種模式識別受體,在識別外來病原體侵

4、染等方面起著非常重要的作用。在我們的研究中,從克氏原螯蝦體內克隆到一種新型的C-型凝集素,稱為PcLec4。PcLec4包括一個由17個氨基酸殘基組成的信號肽和緊隨其后的一個糖類識別結構域(carbohydraterecognition domain,CRD)。在螯蝦受到白斑病毒或者鰻弧菌(Vibrio.anguillarum)的刺激之后,該C-型凝集素的mRNA水平上呈現(xiàn)明顯的上調趨勢。重組表達之后的該C-型凝集素蛋白不能凝集細菌,但

5、是在體外細菌結合試驗中,對無論革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌都表現(xiàn)出很強的結合活性。重組表達后的蛋白可以促進機體對侵入體內的鰻弧菌的清除,為了研究該凝集素的體內活性,我們利用含有白斑綜合癥病毒的即刻早期基因(immediate-early gene)中的ie1啟動子核心區(qū)域的表達載體,將PcLec4的開放閱讀框插入該質粒載體中ie1啟動子之后。該載體經測試表明可以在螯蝦體內過表達PeLec4,并且注射了該表達載體的螯蝦與對照組相比,當鰻弧