雙鏈RNA對細(xì)胞凋亡和HBV復(fù)制的影響及細(xì)胞黏附對藥物誘導(dǎo)凋亡的影響.pdf

1、研究表明,長雙鏈RNA會引發(fā)干擾素(interferon,IFN)防御途徑的激活,從而激活雙鏈RNA依賴蛋白激酶(Double-strandedRNA-dependent protein kinase,PKR),使其與長雙鏈RNA結(jié)合形成二聚體,一方面磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子(eukaryotic InitiationFactor-2 alpha,elF-2α),抑制蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;另一方面,磷酸化轉(zhuǎn)錄因子NF-KappaB

2、的抑制因子,使NF-KappaB活化,引起IFN相關(guān)刺激因子啟動子激活,導(dǎo)致IFN轉(zhuǎn)錄增加。為研究長雙鏈RNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制,我們以長雙鏈RNA、短雙鏈RNA分別轉(zhuǎn)染HepG2.215細(xì)胞后,定量RT-PCR檢測干擾素表達(dá)、DNA FragmentationELISA檢測凋亡。結(jié)果表明,長雙鏈RNA使細(xì)胞中IFN表達(dá)水平上調(diào),凋亡增加,而短雙鏈RNA不會引起IFN水平的上調(diào)和凋亡。
　　 RNA干擾(RNA Interfer

3、ence,RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)特異性的降解同源mRNA,致靶基因的表達(dá)沉默。dsRNA進(jìn)入細(xì)胞,在Dicer的切割下生成21-23nt的短鏈dsRNA,即小干擾RNA(Small Interfering RNA,siRNA),隨后結(jié)合核酶復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA inducedsilencing complex,RISC),RISC識別同源性的

4、mRNA并將其降解。我們選取長雙鏈RNA(即dsRNA)、短雙鏈RNA(即siRNA)轉(zhuǎn)染HepG2.215細(xì)胞,ELISA測得細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的含量,與對照組相比,HBsAg、HBeAg含量降低,說明通過RNAi可以抑制HBV的復(fù)制。
　　 在前述的轉(zhuǎn)染過程中我們發(fā)現(xiàn),細(xì)胞貼壁更緊密時,后續(xù)轉(zhuǎn)染過程測定的凋亡率低于貼壁不緊密的細(xì)胞組。因此,我們推測細(xì)胞的黏附強(qiáng)弱不N會影響細(xì)胞的凋亡。為證實假設(shè),我們選用IFN、

5、5-氟尿嘧啶分別誘導(dǎo)經(jīng)不同處理因素作用后的HepG2、HEK293細(xì)胞,實驗發(fā)現(xiàn),經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)處理后的培養(yǎng)板,會增強(qiáng)細(xì)胞的貼壁生長能力,使細(xì)胞對藥物的敏感性下降,增殖抑制率、凋亡率均下降;而在細(xì)胞未貼壁時加入Fn抗體阻斷基質(zhì)中重要成分一纖維粘連蛋白(Fn)后,會使細(xì)胞對藥物的敏感性增加,增殖抑制率、凋亡率均上升;IFN作用不同黏附作用處理后的細(xì)胞組,Western檢驗其PKR水平均升高,但組間無明顯差異。
　　 綜合前述各項研