p38MAPK四亞基在食管鱗癌惡性表型中的功能研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在探討p38 MAPK4亞基（即p38α，p38β，p38γ和p38δ）在食管鱗癌細(xì)胞惡性行為中的作用，探討p38α，p38β，p38γ和p38δ表達(dá)的臨床病理學(xué)意義；在細(xì)胞水平分析p38α，p38β，p38γ和p38δ在細(xì)胞增殖，遷移，浸潤，周期和凋亡中的作用；同時(shí)，構(gòu)建p38γ和p38δ慢病毒干擾及過表達(dá)載體，流式細(xì)胞儀分選陽性細(xì)胞，皮下注射裸小鼠構(gòu)建皮下荷瘤動(dòng)物模型，觀察p38γ和p38δ在體內(nèi)成瘤中的作

2、用。
　　方法：
　　運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)在食管鱗癌的組織芯片上檢測p38β，p38γ和p38δ的表達(dá)水平，運(yùn)用卡方統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法分析p38β，p38γ和p38δ表達(dá)的臨床病理學(xué)意義（包括患者年齡，性別，臨床分期，T分期，N分期，分化程度，腫瘤大小及大類型）；同時(shí)，運(yùn)用Kaplan-Meier生存曲線分析p38β，p38γ和p38δ表達(dá)水平與患者的總預(yù)后的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。在體外食管癌細(xì)胞系Eca109中，針對p38α，p38β

3、，p38γ和p38δ的cDNA序列，我們分別構(gòu)建了短發(fā)夾RNA干擾載體（shRNA）和真核過表達(dá)載體， Lipofectamine2，000轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞；運(yùn)用western-blot檢測所構(gòu)建干擾或過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果；運(yùn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測p38α，p38β，p38γ和p38δ干擾或過表達(dá)后食管癌細(xì)胞Eca109的遷移變化；運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測p38α，p38β，p38γ和p38δ干擾或過表達(dá)后食管癌細(xì)胞Eca109的

4、浸潤變化；運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡的變化。最后針對研究相對較少的p38γ和p38δ，我們分別構(gòu)建了其慢病毒干擾和過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p38γ穩(wěn)定敲低和p38δ過表達(dá)的Eca109細(xì)胞系，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選出陽性細(xì)胞。最后將流式細(xì)胞儀分選出陽性細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，并且皮下注射裸小鼠，構(gòu)建Eca109細(xì)胞皮下荷瘤小鼠模型，觀察p38γ和p38δ基因在體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　

5、第一部分：相比癌旁正常組織，p38α在食管癌組織中顯著性高表達(dá)（P=0.000）；其表達(dá)水平與臨床病理學(xué)參數(shù)，如：年齡（P=0.436），性別（P=1.000），臨床分期（P=0.514），T分期（P=0.429），N分期（P=0.646），分化程度（P=0.670），腫瘤大?。≒=0.610）和大體類型（P=0.551）均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，與患者的總預(yù)后也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P＞0.05）；相比癌旁正常組織，p38β在食管癌組織中顯

6、著性高表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；且p38β表達(dá)與腫瘤大小具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P=0.044）。但與其他臨床病理學(xué)參數(shù)，如，性別（P=0.730），年齡（P=0.294），臨床分期（P=0.118），T分期（P=0.692），N分期（P=0.109），分化程度（P=0.470）和大體類型（P=0.609）均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性；p38γ在癌和癌旁組織中表達(dá)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P=0.365），與性別（P=1.000），年齡

7、（P=0.609），T分期（P=0.063），分化程度（P=0.0.093）和大體類型（P=0.315）等參數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，但是與臨床分期（P=0.017），N分期（P=0.008），腫瘤大?。≒=0.017）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性；相比癌旁正常組織，p38δ在食管癌組織中顯著性高表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；但是p38δ的表達(dá)與其他臨床病理學(xué)參數(shù)，如性別（P=1.000），年齡（P=0.603），臨床分期（P=0.089

8、），T分期（P=0.646），N分期（P=0.568），分化程度（P=0.791）和大體類型（P=0.575）均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。運(yùn)用Kaplan-Meier生存曲線分析p38β的表達(dá)與食管癌患者的總預(yù)后具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P=0.012），p38γ和p38δ的表達(dá)與患者總預(yù)后均無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P=0.667和P=0.364）。
　　第二部分：在體外食管癌細(xì)胞系水平，我們發(fā)現(xiàn)干擾p38α，p38β，p38γ和p38δ亞基后，相比對

9、照組p38α能夠顯著性地促進(jìn)Eca109的增殖，遷移和浸潤；但是干擾p38β，p38γ和p38δ亞基后能夠顯著性地抑制Eca109的增殖，遷移和浸潤。轉(zhuǎn)染真核過表達(dá)質(zhì)粒后，表型則相反。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，相比對照組，干擾p38α后能夠抑制能夠顯著性地抑制Eca109的凋亡，周期S期顯著性增加；干擾p38β，p38γ和p38δ亞基后能夠抑制能夠顯著性地促進(jìn)Eca109的凋亡，周期S期顯著性降低；轉(zhuǎn)染真核過表達(dá)質(zhì)粒后，凋亡和周期表型則相反

10、。
　　第三部分：皮下荷瘤小鼠模型結(jié)果顯示，與對照組相比，p38δ亞基過表達(dá)后，在裸鼠皮下能夠顯著性的促進(jìn)腫瘤生長；與對照組相比，而p38γ敲低后，在裸鼠皮下能夠顯著性的抑制腫瘤生長。提示p38γ和p38δ亞基均能促進(jìn)體內(nèi)食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論：
　?。?）在臨床組織水平除了p38γ亞基在食管癌和癌旁組織中表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余三個(gè)亞基，即p38α，p38β和p38δ亞基均在食管癌組織中顯著性