納米銀對斑馬魚卵母細胞成熟的影響.pdf

1、納米材料是指三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1-100nm)的材料，由于其特殊的物理化學性質，已被廣泛用于工業(yè)領域。其中，納米銀(silver nanoparticles，AgNPs)因為具有良好的長效、廣譜抗菌活性而被應用于醫(yī)療器械，家用電器，衣服，洗發(fā)水和包裝袋等日常用品之中，是應用最廣泛的納米材料之一。因為AgNPs會被直接或者間接地釋放到水環(huán)境中，會對水生生物以及人類健康造成潛在的威脅，因此其環(huán)境生態(tài)風險效應是近年來的研究

2、熱點。目前關于AgNPs對水生生物影響的研究，主要集中在浮游植物、藻類、魚類的胚胎發(fā)育和幼魚，而有關其對成魚的生殖生理的影響研究相對較少。
　　魚類卵母細胞發(fā)育到完全生長期后，孕激素(17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one，DHP)可誘導其最終成熟，即生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD）。該過程可在體外誘導實現(xiàn)，且成熟后的卵母細胞會變得透明，因此是一種很好的研究脊

3、椎動物卵母細胞成熟的實驗模型。本實驗以斑馬魚（Danio rerio）的卵母細胞為研究對象，通過體外培養(yǎng)的方式，再結合形態(tài)學、生物化學和分子生物學等技術手段，研究了AgNPs對斑馬魚卵母細胞成熟的影響。為了明確AgNPs所引起的作用是來自其本身，還是其緩慢釋放出的銀離子（Ag+），我們同時研究了硝酸銀(AgNO3)對卵母細胞成熟的影響。研究結果首次發(fā)現(xiàn)AgNPs會誘導卵母細胞的成熟，并深入研究了其成熟的機制。主要研究結果如下:
　

4、　1.斑馬魚卵母細胞用AgNPs和AgNO3暴露4 hours(hr)后不但沒有抑制由DHP誘發(fā)的GVBD過程，反而能誘發(fā)GVBD。在10mg/L AgNPs和1mg/L AgNO3濃度下，AgNPs和AgNO3所引起的GVBD率分別為56.10±5.41％和40.50±6.56％，這與10ng/mL DHP引起的GVBD率（66.67±4.17％）相當，且均顯著(p＜0.05)高于對照（7.25±1.46％）。但隨著AgNPs和AgN

5、O3濃度升高，卵母細胞的畸形率會上升。
　　2.由于卵母細胞內環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度的降低是啟動卵母細胞發(fā)生GVBD的一個重要因素，我們進一步檢測AgNPs和AgNO3暴露后對卵母細胞cAMP濃度的變化的影響。結果表明，30mg/L AgNPs和10mg/L AgNO3暴露2hr后，卵母細胞（尚未出現(xiàn)GVBD）內cAMP濃度分別下降到4.50±0.60pmol/mL和3.78±0.53pmol/mL，顯著低于對照組（8.96±

6、1.73pmol/mL）(p＜0.05)，這與10ng/mL的DHP處理組（3.95±0.61pmol/mL）的作用效果相似。
　　3.由于卵母細胞內cAMP主要來自于外圍的濾泡層細胞，提示AgNPs可能影響濾泡層細胞的生理狀態(tài)。我們使用透射電鏡(TEM)對濾泡層細胞的超微結構進行觀察。經AgNPs(30mg/L)和AgNO3(10mg/L)處理4hr后，濾泡層中的顆粒細胞和鞘膜細胞都呈現(xiàn)不正常的細胞形態(tài):核凝聚，胞質皺縮等。Ag

7、NO3處理組的卵母細胞線粒體還呈現(xiàn)腫脹，以及空泡化等細胞凋亡的特有現(xiàn)象。我們進一步使用檢測細胞凋亡的熒光染料Hoechst33342對濾泡層細胞進行染色，發(fā)現(xiàn)AgNPs和AgNO3會引起濾泡層細胞出現(xiàn)明顯的凋亡。卵母細胞經AgNPs(10mg/L)處理3hr后，濾泡層有多數(shù)細胞凋亡，經AgNPs(30mg/L)和AgNO3(10mg/L)處理1hr后，就已經有大量濾泡層細胞凋亡。
　　4.進一步檢測與凋亡和氧化應激相關的基因表達發(fā)

8、現(xiàn)，卵母細胞經AgNPs(10mg/L)和AgNO3(1mg/L)處理后，與凋亡相關基因caspase9和caspase3的表達水平顯著上調。同樣，mt2（metallothionein-2，金屬硫蛋白）也在AgNPs和AgNO3處理組中顯著上調。與氧化應激相關的gst2（glutathione S transferase pi2，谷胱甘肽轉移酶）的表達水平只在AgNPs處理組中有顯著上升。Hsp70（heat shock protei

9、n70，熱休克蛋白）是最敏感的基因，卵母細胞用AgNPs和AgNO3處理后，hsp70的表達量分別被上調了5和300倍。
　　綜上所述，AgNPs和Ag+能誘導卵母細胞的成熟過程。其作用機理主要是通過引起卵母細胞外圍的濾泡層細胞凋亡，間接引起卵母細胞內的cAMP濃度下降，最終引起卵母細胞出現(xiàn)GVBD?；虮磉_結果顯示，AgNPs和Ag+引起濾泡層凋亡的機制存在少許差異。因此，AgNPs和Ag+引起濾泡細胞凋亡的細胞內通路有可能不同