顱內(nèi)T淋巴細胞在腦出血后的變化規(guī)律及姜黃素的干預(yù)作用.pdf

1、腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)嚴(yán)重威脅人類的健康，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點。為了提高ICH患者的臨床療效，重點在于更好地了解ICH后導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的機制。
　　健康的大腦擁有完整的血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)，T淋巴細胞幾乎不能遷移入腦實質(zhì);ICH發(fā)生后，白細胞等外周免疫細胞可以大量進入腦實質(zhì)，聚集在血腫的周圍，產(chǎn)生作用。在哺乳動物的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中，T淋巴細

2、胞對抗病原菌入侵中也起著核心的作用。而且越來越多的證據(jù)表明免疫炎癥反應(yīng)在ICH后的繼發(fā)性腦損傷中起著重要的作用。各種免疫活性成分如促炎細胞因子、補體、中性粒細胞的浸潤和小膠質(zhì)細胞的激活與腦出血后的繼發(fā)性損傷有關(guān)。在實驗性ICH中，腦內(nèi)白細胞包括中性粒細胞的浸潤引起的先天性免疫反應(yīng)已被證實。雖然不同的淋巴細胞亞群在腦缺血中強大的保護或損害作用已被闡明，但ICH中發(fā)生后顱內(nèi)浸潤的T淋巴細胞很少被關(guān)注。
　　姜黃素已被發(fā)現(xiàn)可以通過BBB

3、并在腦組織中保持較高的生物活性，它能有效的保護ICH后的BBB損傷，本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制脊髓損傷后的膠質(zhì)瘢痕形成和腦外傷的炎癥反應(yīng);同時也有研究表明它能抑制由不同的有絲分裂如ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖和差異性調(diào)節(jié)CD4+輔助性T淋巴細胞的細胞應(yīng)答作用。因此，本研究的目的是了解ICH后腦內(nèi)浸潤T淋巴細胞的變化規(guī)律和證實BBB的破壞可以促進外周T淋巴細胞遷移入腦內(nèi)。此外，我們采用小鼠自體血ICH模型探討姜黃素治療能否減少腦浸潤

4、T淋巴細胞的數(shù)量，從而改善神經(jīng)功能，進而從某種程度上改善神經(jīng)炎癥。
　　一、腦出血后腦內(nèi)浸潤T淋巴細胞隨時間的變化
　　目的:了解腦出血后的T淋巴細胞浸潤的時間變化規(guī)律和探討B(tài)BB的破壞和T淋巴細胞浸潤的關(guān)系。
　　方法:C57小鼠自體血注射制作腦出血模型。在ICH后的0、1、3、5、7、14天，挑選右側(cè)大腦半球（出血側(cè)），運用特異的T淋巴細胞標(biāo)志物(CD45，CD11b，CD3，CD4，CD8)，進行流式細胞技術(shù)檢測

5、。BBB的分子機制緊密連接蛋白(claudin5、ZO-1、Occludin)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的蛋白表達運用運用Western blot進行測定，同時claudin5采用免疫熒光技術(shù)檢測。血腦屏障的通透性采用伊文思藍染料滲透分析。
　　結(jié)果:1、腦內(nèi)T淋巴細胞浸潤在ICH后的第3天大量聚集在血腫周圍，第5天達到高峰;同時伊文思藍的通透和緊密連接蛋白的表達也有相似的結(jié)果。
　　2、在ICH后的第5天，同組小鼠的出

6、血側(cè)大腦的T淋巴細胞和MMP9的表達明顯高于未出血側(cè)。
　　結(jié)論:結(jié)果表明，腦浸潤T淋巴細胞與ICH的發(fā)生擁有時間依賴性，ICH發(fā)生后，T淋巴細胞的浸潤在損傷側(cè)的大腦陽性表達較明顯，且與BBB的破壞有關(guān)系。
　　二、姜黃素可降低腦出血后腦內(nèi)T淋巴細胞的浸潤
　　目的:探討姜黃素是否能夠降低實驗性小鼠腦出血顱內(nèi)T淋巴細胞的浸潤。
　　方法:小鼠隨機分為三組;對照組（sham組），腦出血+溶劑干預(yù)組(ICH+vehi

7、cle)，腦出血+姜黃素治療組(ICH+Cur)。姜黃素溶于DMSO中，100mg/kg腹腔注射。對照組和腦出血+溶劑干預(yù)組注射相同體積的DMSO。用流式細胞儀檢測出血側(cè)顱內(nèi)淋巴細胞的亞型及數(shù)量。免疫熒光技術(shù)檢測T淋巴細胞和VCAM-1的表達。在腦出血72h后，神經(jīng)功能測評采用28分神經(jīng)功能評分、轉(zhuǎn)角試驗和前肢放置試驗。腦含水量用濕/干法進行檢測。VCAM-1、IFN-γ和IL-17在腦內(nèi)得蛋白表達采用Western blot檢測。腦內(nèi)

8、血腫大小采用MRI測定。在腦出血后的第5天，BBB的分子機制緊密連接蛋白(claudin5、ZO-1、Occludin)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的蛋白表達運用運用Western blot進行測定。血腦屏障的通透性采用伊文思藍染料滲透和熒光進行分析。
　　結(jié)果:1、在ICH后72小時，姜黃素治療可明顯改善神經(jīng)功能的缺損和降低腦水腫。
　　2、姜黃素可減少血腫周圍的T淋巴細胞的聚集，同時流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)姜黃素治療組也能明

9、顯的減少顱內(nèi)浸潤T淋巴細胞的數(shù)量
　　3、Western blot分析和免疫組織化學(xué)染色表明姜黃素治療可以顯著降低血管上VCAM-1的表達，同時也減少了顱內(nèi)IFN-γ和IL-17的表達。
　　4.在ICH后的第5天，姜黃素能夠有效地保護BBB，并同時減少顱內(nèi)T淋巴細胞的浸潤。
　　結(jié)論:本部分研究結(jié)果表明，姜黃素治療后可減輕ICH導(dǎo)致的腦組織炎癥和腦水腫，至少在一定程度上與顱內(nèi)T淋巴細胞的浸潤有關(guān)系;T淋巴細胞的浸潤與