SPINK3調節(jié)大鼠正常肝細胞BRl-3A增殖的分子機理研究.pdf

1、研究表明,絲氨酸蛋白酶抑制劑Ⅲ(serine peptidase inhibitor, Kazal type3,SPINK3)不僅是一種胰蛋白酶抑制劑,而且是一類結構與表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)相似的信號分子,能夠與EGFR結合進而促進細胞增殖。本實驗室在研究大鼠肝再生功能基因組學的基礎上,發(fā)現(xiàn)SPINK3在大鼠再生肝中表達顯著增強。同時,有文獻報道其與大鼠腸上皮細胞IEC-6的細胞增殖密切相

2、關。然而,SPINK3對肝細胞增殖、肝再生的作用和調控機制尚未有人報道。為此,本課題擬深入研究SPINK3調控大鼠正常肝細胞BRL-3A增殖的分子機理。
　　為了解SPINK3在大鼠肝再生中調控肝細胞增殖的作用及其調節(jié)機理,本文用大鼠全基因組芯片Rat Genome2302.0檢測部分肝切除后再生肝的基因表達變化,發(fā)現(xiàn)SPINK3在部分肝切除(partial hepatectomy, PH)后2-24 h和72-168 h表達顯著

3、上調,其促進細胞增殖的過程基本與大鼠肝再生進程相符,本文用qRT-PCR和Western Blot驗證芯片檢測結果的可靠性。結合文獻資料用IPA(Ingenuity Pathway Analysis9.0,IPA)軟件構建SPINK3調控肝再生的信號網(wǎng)絡并分析其可能的作用機理,表明SPINK3可與EGFR結合,通過p38MAPK、PKC、JAK-STAT和AKT等四條信號通路調控肝細胞增殖,進一步分析表明,上述四條信號通路均對細胞增殖起

4、到促進作用。綜上所述,SPINK3在大鼠肝再生中可能通過上述信號通路促進肝細胞增殖,進而促進肝臟再生。
　　為驗證上述推測,本文用基因添加和干涉的方法處理BRL-3A細胞,對SPINK3調節(jié)BRL-3A細胞增殖的分子機理進行了初步研究。本文首先構建了SPINK3的過表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-SPINK3,包裝慢病毒后侵染BRL-3A細胞,篩選出陽性單克隆,以獲得能夠穩(wěn)定過表達SPINK3的BRL-3A

5、細胞。同時設計并合成了兩條SPINK3特異性小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)片段,脂質體轉染法轉染BRL-3A細胞后,運用qRT-PCR篩選出最佳干涉片段,進而獲得干涉SPINK3表達的BRL-3A細胞。MTT法分析SPINK3表達變化對BRL-3A細胞活力的影響,結果顯示SPINK3過表達組細胞在24、48、72和96 h的細胞活性均比其對照組高;而轉染siRNA1后,BRL-3A細胞在48和72

6、 h細胞生長明顯受到抑制。通過BrdU摻入法分析干涉SPINK3表達對BRL-3A細胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)siRNA1轉染BRL-3A細胞后48 h細胞增殖明顯受到抑制;利用流式細胞術檢測SPINK3表達變化對BRL-3A細胞增殖和細胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)過表達SPINK3基因對BRL-3A細胞增殖有促進作用,對BRL-3A細胞凋亡有顯著抑制作用(P＜0.05);而干涉SPINK3基因表達則顯著抑制BRL-3A細胞增殖(P＜0.05),促進BR

7、L-3A細胞凋亡。用qRT-PCR和Western Blot等方法檢測上述材料的SPINK3及其受體EGFR和相應信號通路的相關基因和蛋白的表達變化,進而分析大鼠肝再生中SPINK3調控肝細胞增殖的機理。結果表明,過表達SPINK3時,SPINK3信號通路基因ERK1、AKT1、STAT3,轉錄因子NF-κB1及其下游靶基因CCND1等表達上調;siRNA干涉SPINK3表達時,這些基因和蛋白表達下調。由此得出結論,SPINK3通過調節(jié)