190CT3多肽調節(jié)白血病細胞增殖分化的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的：白血病是起源于造血干細胞的惡性疾病,俗稱血癌。白血病細胞具有腫瘤細胞的生長特點：增殖失控、分化障礙、凋亡受阻,白血病細胞大量增生累積,而使得正常造血功能受到抑制,至今無有效治療方法。目前,科學家提出人體所有疾病都可以從信號轉導異常的角度重新認識,細胞信號轉導機制和各種疾病發(fā)生機制的闡明,使得很多信號分子可以作為治療這些疾病的藥物篩選靶位,由此產生了信號轉導藥物。 白血病抑制因子是一種細胞因子,最早于1988年在小

2、鼠KrebsⅡ腹水瘤細胞條件培養(yǎng)液中被純化,因其能夠誘導白血病細胞株M1細胞向正常細胞分化,故稱白血病抑制因子。LIF因子是一種多功能的細胞因子,它能夠抑制HL-60,K562,U937等白血病細胞的增殖。同時LIF對于干細胞的增殖分化也有廣泛的調節(jié)作用,最典型的生物學功能是抑制胚胎干細胞的分化,維持其增殖和干細胞的多能性。LIF的生物學效應是其首先與LIF受體的a亞基(gp190)結合,并使之與另一β亞基(gp130)結合,形成異源性

3、二聚化結構,從而啟動細胞內信號轉導通路使胞外的信息傳入核內,調控特定基因的表達,使細胞發(fā)生一系列的變化。在LIF調節(jié)白血病細胞增殖分化的過程中,JAK-STATS信號轉導通路是LIF產生活性的重要途徑,而在眾多的STATS分子,STAT3信號分子的激活與調節(jié)白血病細胞的分化最為密切。 gp190(LIFRα亞基)是低親和力的LIF特異性受體,屬于造血細胞受體超家族,其缺乏內生激酶的活性。生理狀態(tài)下存在可溶性LIFR和跨膜LIFR

4、?？扇苄允荏w,游離于胞外,沒有跨膜區(qū)和細胞內區(qū)?？缒さ腖IFR(gp190)胞內區(qū)含有三個功能域--BOX1、BOX2和BOX3。YXXQ結構是激活細胞內信號轉導的必需序列,位于遠膜端(Y酪氨酸,X任意氨基酸,Q谷氨酰胺),它能與STAT3的SH2位點特異性識別結合,是STAT3磷酸化的必須結構。Hermanns證實LIF受體a亞基細胞內區(qū)近膜端與STAT3結合,遠膜端激活STAT3。Tomida等研究發(fā)現,LIFR gp190亞基胞內

5、區(qū)具有信號傳導的功能。有關膜受體信號啟動位點的游離多肽對細胞增殖分化的影響也已有相關的報道,單一亞基的單一信號啟動位點在離膜狀態(tài)下完全能夠在細胞內啟動相應的信號轉導通路。 在我們以往的研究工作中發(fā)現,在沒有LIF因子的誘導下,高表達的LIFRa亞基也可使白血病細胞下游的信號轉導通路激活。按照LIFRa亞基細胞內區(qū)第三個功能域(Box3)設計一種小分子--190CT3,并使其在白血病細胞內表達,通過檢測JAK/STAT3及P44/

6、42 MAPK信號轉導通路下游信號分子及其磷酸化水平,研究發(fā)現其確實具有LIF受體的信號啟動效應從而抑制白血病細胞的生長。通過動物裸鼠體內實驗,結果發(fā)現,HL-60-190CT3細胞株注射的裸鼠與其他兩組(HL-60和HL-60-3.0細胞)相比脾臟、腎臟、肝臟以及肺等組織內的腫瘤細胞增生、充血水腫明顯減少,HE染色后顯微鏡下觀察發(fā)現：多個器官血管增生和淋巴細胞浸潤現象明顯低于其他兩組,證明其轉染了目的基因190CT3的白血病細胞毒性明

7、顯降低。 本實驗研究目的著重于鑒定并明確190CT3多肽的活性和功能,制備并獲取190CT3多肽,進一步為成功研制對白血病細胞有較特異殺傷作用的新的生物學藥物提供臨床應用依據。 研究方法：本實驗首先獲得了重組190CT3和190CT3-myc兩種CHO表達細胞株,以高效表達目的基因的CHO細胞作為蛋白供體。將獲得高效表達目的基因的CHO細胞株與HL-60細胞共培養(yǎng)。利用RT-PCR,免疫熒光細胞化學、westernblo

8、t,流式細胞儀,AO/EB,Annexin-V/PI,激光共聚焦等生物學實驗方法,從細胞形態(tài)觀察,蛋白表達量高低的鑒定,分子磷酸化水平等方面分析細胞形態(tài)學變化、細胞增殖核抗原(PCNA)和粒細胞表面抗原CD15在共培養(yǎng)后白血病細胞的變化,分析190CT3多肽是否可以啟動白血病細胞下游的信號轉導,進而抑制白血病細胞的增殖并促進其在一定程度的分化。另一方面我們也通過細胞凋亡實驗,排除了其誘導白血病細胞凋亡的作用。并通過親和層析的方法分離純化

9、獲得190CT3功能多肽。 結果發(fā)現：1)構建190CT3-mvc cDNA表達載體：藉HindⅢ和Xba I位點將目的片段重組于T載體中。然后轉化入DH5a中,涂平板、挑克隆,用HindⅢ和XbaI酶切鑒定,證實重組質粒中含有預期大小的片段(400bp左右),挑選含有插入片段的重組子T-190CT3myc進行測序,且無堿基突變。將目的片段酶切后重新連入真核表達載體pcDNA3.0中,成功構建重組pcDNA3.0-190CT3m

10、yc的真核表達載體。2)通過脂質體轉染,將空載體和兩種重組子分別導入處于對數生長期的CHO細胞,G418篩選(終濃度2800ug/ml),挑選G418陽性克隆。成功構建了三種細胞株:pcDNA3.0-190CT3重組子CHO細胞株(CHO-190CT3)、pcDNA3.0-190CT3myc重組子CHO細胞株(CHO-190CT3myc)、pcDNA3.0 CHO細胞株(CHO-3.0);3)RT-PCR檢測到190CT3在mRNA水平

11、上的表達。挑取表達目的基因比較高的細胞株繼續(xù)擴大培養(yǎng),細胞免疫熒光化學和westernblot均檢測到190CT3多肽的表達,而轉染pcDNA3.0空載體的CHO細胞未檢測到190CT3多肽的表達。共培養(yǎng)后白血病細胞的形態(tài)學改變:CHO-190CT3細胞株與HL-60和K562細胞共培養(yǎng)1周后,共培養(yǎng)后的HL-60和K562細胞與野生型HL-60細胞相比細胞體積變大,形狀變得不規(guī)則,K562細胞呈明顯的氣球樣變。而與CHO-3.0細胞株

12、共培養(yǎng)1周后的HL-60和K562細胞形狀規(guī)則,變化不明顯。4)Western blot檢測細胞核增值抗原PCNA的表達水平,與CHO-190CT3共培養(yǎng)的HL-60細胞株PCNA的表達水平低于其他兩組；4)流式細胞儀檢測粒細胞表面抗原CD 15發(fā)現,與CHO-190CT3共培養(yǎng)的HL-60和K562細胞CD15陽性細胞百分數均高于其他兩組細胞；5)westernblot檢測下游信號分子STAT3和STAT3磷酸化水平發(fā)現與CHO-19

13、0CT3共培養(yǎng)HL-60細胞組與其他兩組細胞相比,STAT3及其磷酸化水平升高；激光共聚焦顯示較強于其它兩組的陽性信號并且有STAT3信號分子入核。6)吖啶橙(AO)/溴乙錠(EB)和Annexin-V/PI雙染色實驗檢測細胞凋亡情況,三組細胞均未見有明顯的凋亡現象。因此排除了190CT3多肽對白血病細胞的促凋亡作用。 本研究結果表明：190CT3重組子可以在CHO細胞中表達,通過與白血病細胞共培養(yǎng)的方法,檢測JAK/STAT3