人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞凋亡新生抗原與原發(fā)性膽汁性肝硬化膽管特異性損傷相關(guān)性的研究.pdf

1、凋亡（Apoptosis），又稱程序化細(xì)胞死亡，是機(jī)體維持自穩(wěn)狀態(tài)最重要的機(jī)制之一。健康成年人每天平均有500億至700億個(gè)衰老、惡變、或損傷的細(xì)胞發(fā)生凋亡，絕大部分凋亡細(xì)胞在啟動(dòng)凋亡程序后裂解為凋亡小體（apoptotic body），凋亡小體被局部吞噬細(xì)胞識(shí)別并以一種非炎性的方式清除，同時(shí)新生細(xì)胞得以再生并籍此維持組織穩(wěn)態(tài)。理論上說(shuō)凋亡是一種近乎完美的機(jī)制，但近年來(lái)，已有研究證實(shí)體細(xì)胞非正常凋亡與自身免疫性疾病有著千絲萬(wàn)縷的關(guān)系，凋

2、亡小體中包含的細(xì)胞內(nèi)成分如果沒(méi)有經(jīng)過(guò)有效的加工可能無(wú)法被吞噬細(xì)胞識(shí)別處理從而形成新的自身抗原，這種特殊的自身抗原被稱為凋亡新生抗原，其英文名apotope 則源自凋亡（apoptosis）和抗原表位（epitope）。凋亡新生抗原的產(chǎn)生多由于靶細(xì)胞存在特異性分化缺陷，凋亡后無(wú)法加工分解某一類(lèi)自體蛋白，導(dǎo)致該類(lèi)蛋白經(jīng)由凋亡小體長(zhǎng)期在局部吞噬細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞中積累，并最終打破免疫耐受成為自身抗原，導(dǎo)致器官特異性自身免疫損傷。
　　

3、 原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary billary cirrhosis，PBC）是一種典型的器官特異性自身免疫性疾病，主要累及中年女性，在歐美40歲以上女性中發(fā)病率達(dá)到千分之一，在我國(guó)發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì)。PBC的主要病理學(xué)特征為免疫細(xì)胞特異性識(shí)別并殺傷肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（human intrahepatic biliary epitheliAlcells，HiBEC），導(dǎo)致肝內(nèi)小膽管漸進(jìn)性消失，肝內(nèi)膽汁淤積致肝組織反復(fù)再生并發(fā)生纖

4、維化，最終導(dǎo)致肝硬化和肝功能衰竭，PBC 整個(gè)病程長(zhǎng)達(dá)20年以上，除部分晚期患者進(jìn)行肝臟移植外，目前尚缺少有效治療手段。免疫學(xué)方面，PBC患者血清中存在高滴度自身抗體，目前已鑒定的自身抗原主要包括位于線粒體內(nèi)膜的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2 亞基(PDC-E2)， 2-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合體E2 亞基(OGDC-E2)和支鏈2-氧酸脫氫酶復(fù)合體(BCOADC-E2)，除自身抗體外，PBC患者體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)PDC-E2抗原特異性T細(xì)胞。
　　

5、 目前在PBC 研究領(lǐng)域最重要的一個(gè)問(wèn)題是：PDC-E2等自身抗體廣泛存在于各類(lèi)有核細(xì)胞，為什么PBC患者的免疫系統(tǒng)卻特異性攻擊HiBEC細(xì)胞？換言之，免疫學(xué)研究需要解釋發(fā)生在PBC中的器官特異性問(wèn)題。為解決這一問(wèn)題，結(jié)合凋亡新生抗原理論，本研究提出以下假說(shuō)并利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：人HiBEC細(xì)胞存在缺陷，導(dǎo)致某些線粒體內(nèi)膜蛋白在凋亡后無(wú)法降解，這些無(wú)法降解的蛋白通過(guò)凋亡小體被肝內(nèi)吞噬細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞捕獲并遞呈，導(dǎo)致自身抗原外漏并可能最終引起

6、免疫耐受的缺失引發(fā)疾病。在此基礎(chǔ)上，我們還想證明這些包含有PBC 特異抗原的凋亡小體是否具有免疫原性，在PBC 狀態(tài)下，我們認(rèn)為凋亡的膽管上皮細(xì)胞釋放的凋亡小體主要可能影響2種細(xì)胞即專業(yè)吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞和非專業(yè)吞噬細(xì)胞如膽管上皮細(xì)胞本身，已有報(bào)道證實(shí)PBC患者的巨噬細(xì)胞在膽管上皮細(xì)胞和凋亡小體和抗線粒體抗體同時(shí)刺激的情況下會(huì)大量釋放促炎性細(xì)胞因子，而膽管上皮細(xì)胞本身是否介入凋亡細(xì)胞的清除，如果介入，這些包含自身抗原的凋亡小

7、體對(duì)膽管上皮細(xì)胞又有何影響？上述問(wèn)題的解決將會(huì)更合理的解釋PBC中膽管上皮特異性損傷，并有助于揭示PBC 更細(xì)致的免疫致病機(jī)制，為可能免疫學(xué)治療提供介入位點(diǎn)。
　　 第一部分肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及凋亡的誘導(dǎo)：
　　 在此部分中研究中，我們主要建立了人HiBEC細(xì)胞，人乳腺上皮細(xì)胞，人支氣管上皮細(xì)胞和人表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)體系。人HiBEC細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞角蛋白18，19免疫熒光染色鑒定陽(yáng)性率達(dá)90％以上。在此基礎(chǔ)上我們分別

8、利用親水性膽鹽甘氨鵝脫氧膽酸鈉（sodium glycochenodeoxycholate，GCDC），紫外輻射，以及抗Fas抗體誘導(dǎo)上述四種原代培養(yǎng)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果表明GCDC 可有效誘導(dǎo)四種原代培養(yǎng)細(xì)胞系發(fā)生凋亡，經(jīng)濃度梯度實(shí)驗(yàn)證實(shí)GCDC在1mM時(shí)給藥4小時(shí)可以誘導(dǎo)達(dá)高達(dá)90％的人HiBEC細(xì)胞發(fā)生凋亡，同樣的條件也可以有效誘導(dǎo)約其他3種原代細(xì)胞發(fā)生凋亡（凋亡率40％-50％）；而紫外輻射(強(qiáng)度1650J/m2 至2

9、200J/m2)僅能誘導(dǎo)約25％原代細(xì)胞發(fā)生凋亡；盡管四種原代細(xì)胞表面均有較高強(qiáng)度的Fas表達(dá)，但給予Fas抗體卻幾乎無(wú)法誘導(dǎo)凋亡。
　　 親水性膽鹽為人膽汁內(nèi)主要毒性成分，利用GCDC 誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞凋亡較好的模擬了PBC中膽管上皮細(xì)胞的病理性凋亡。我們隨后利用超速離心收集了培養(yǎng)上清中的凋亡小體用于下一階段凋亡新生抗原的研究。
　　 第二部分肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞凋亡新生抗原的鑒定：
　　 在此部分的研究中，我們分

10、離了4種細(xì)胞經(jīng)GCDC 誘導(dǎo)凋亡后的凋亡小體，并利用免疫印跡和激光共聚焦顯微鏡研究了3種PBC 特異性自身抗原（PDC-E2,OGDC-E2,BCOADC-E2），4種線粒體內(nèi)膜蛋白（DECR1,UQCRC2,COX IV，ATPB），和3種PBC 相關(guān)的核蛋白抗原（SSA,SSB，SP100）在4種凋亡小體中分布情況。我們發(fā)現(xiàn)兩種PBC 特異抗原PDC-E2，ODDC-E2 以全長(zhǎng)抗原的形式特異性的存在于HiBEC細(xì)胞來(lái)源的凋亡小體，

11、另一種PBC 特異性抗原BCOADC-E2 除了存在于HiBEC 來(lái)源的凋亡小體，同時(shí)也在另外兩種上皮細(xì)胞（MaEPC,BrEPC）來(lái)源的凋亡小體中被檢測(cè)到。此外，在4種其他線粒體內(nèi)膜蛋白中，DECR1也特異性的存在于HiBEC細(xì)胞來(lái)源的凋亡小體，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)核蛋白抗體特異性的存在與HiBEC 來(lái)源的凋亡小體中。至此，我們檢測(cè)到所有3種PBC 特異性抗原都在膽管上皮細(xì)胞凋亡小體中以全長(zhǎng)蛋白形式特異性的存在。
　　 我們的研究結(jié)果

12、揭示了人類(lèi)上皮細(xì)胞廣泛的存在凋亡后蛋白清除缺陷，由于細(xì)胞凋亡的持續(xù)存在，這些未經(jīng)處理的蛋白在進(jìn)入局部吞噬細(xì)胞或抗原遞呈細(xì)胞后很可能被識(shí)別為外源性蛋白而誘發(fā)免疫應(yīng)答和免疫損傷。更重要的是在HiBEC細(xì)胞，這一缺陷卻恰好導(dǎo)致PDC-E2,OGDC-E2和BCOADC-E2的凋亡后清除障礙，而這三種蛋白是已知的最重要三種PBC 自身抗原，我們的發(fā)現(xiàn)為PBC中致病機(jī)制中包括自身抗原來(lái)源，以及膽管特異性損傷等一系列問(wèn)題提供了較好的一個(gè)相對(duì)較合理的

13、解釋。
　　 第三部分PBC患者血清中抗肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞凋亡新生抗原抗體的鑒定：
　　 在此部分研究中，我們基于對(duì)上述HiBEC 凋亡新生抗原的鑒定結(jié)果繼續(xù)研究這些新生抗原是否在PBC患者中引發(fā)了免疫耐受的缺失，我們從PBC 血清庫(kù)中選取了114例PBC患者的血清，其中95例為抗線粒體抗體陽(yáng)性，19例為抗線粒體抗體陰性，并隨機(jī)選取性別年齡相當(dāng)?shù)?6例對(duì)照血清，其中包括23例系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemiclupus er

14、ythematosus，SLE）， 22例原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosingcholangitis,PSC)以及31例健康對(duì)照。利用免疫印跡檢測(cè)了患者血清中凋亡新生抗原自身抗體的分布情況。
　　 結(jié)果顯示在95例抗線粒體抗體陽(yáng)性的患者中全部（100％）檢測(cè)到了PDC-E2抗體，19例（20％）檢測(cè)到了OGDC-E2抗體，25例（26％）檢測(cè)到了BCOADC-E2抗體，值得一提的是我們新鑒定的膽管上皮細(xì)胞特異

15、性凋亡新生抗原DECR1也在3例患者中檢測(cè)到了抗體，提示PBC患者中存在針對(duì)DECR1的自身免疫也進(jìn)一步驗(yàn)證了我們提出的凋亡新生抗原是潛在的自身抗原來(lái)源的假說(shuō)。此外，抗線粒體抗原陰性患者血清中未能檢測(cè)到任何針對(duì)凋亡新生抗原的抗體。
　　 第四部分肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞對(duì)自身來(lái)源的凋亡小體免疫學(xué)反應(yīng)：
　　 本研究小組已經(jīng)報(bào)道膽管上皮細(xì)胞來(lái)源的凋亡小體具有免疫原性，可以在AMA存在的條件下刺激PBC患者的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞

16、因子。此外，已有報(bào)道證實(shí)PBC患者肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞表面有PDC-E2。為此在此部分研究中我們欲證實(shí)凋亡小體是否是患者肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞表面PDC-E2的來(lái)源.我們首先證實(shí)了膽管上皮細(xì)胞表面表達(dá)包括CD51,CD61，CD93，磷酯酰絲氨酸受體（PSR）等多種吞噬相關(guān)受體以及包括TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR9在內(nèi)的toll 樣受體。將熒光染色后HiBEC 誘導(dǎo)凋亡，收集凋亡小體后與正常HiBEC 共培養(yǎng)，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)的

17、共培養(yǎng)HiBEC內(nèi)細(xì)胞可檢測(cè)到熒光信號(hào)，提示HiBEC 直接參與凋亡小體的清除。經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)HiBEC內(nèi)部存在大量熒光染色的凋亡小體。隨后我們收集了共培養(yǎng)HiBEC細(xì)胞上清和細(xì)胞，檢測(cè)上清中多種促炎性細(xì)胞因子及趨化因子水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)凋亡小體共培養(yǎng)后HiBEC 并不分泌炎性細(xì)胞因子，但趨化因子CXCL-8和CCL-2水平較未刺激組升高約3倍，我們隨后將HiBEC細(xì)胞裂解后提取RNA，利用人趨化因子PCR 芯片分析HiBE