貝氏柯克斯體外膜蛋白與熱休克蛋白融合蛋白的研制及其免疫原性的研究.pdf

1、貝氏柯克斯體是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，為重要人畜共患病Q熱的病原體，也是一種重要的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑。Q熱疫苗接種是預(yù)防貝氏柯克斯體感染的最有效的措施。采用基因工程技術(shù)制備重組保護(hù)性抗原是研制Q熱分子疫苗的重要手段。 貝氏柯克斯體的外膜蛋白P1(分子量為29kDa)、Com1(分子量為27kDa)以及34kDa蛋白(SP34)是重要的保護(hù)性抗原，熱休克蛋白B(HspB)也是其主要表面抗原。另外許多研究證明熱休克蛋白具有的佐劑樣功

2、能，能增強(qiáng)其它抗原的免疫保護(hù)效能。因此，本研究研制了貝氏柯克斯體HspB融合于P1、Com1、SP34外膜蛋白，制備了熱休克蛋白融合蛋白，并對(duì)這些融合蛋白的免疫原性和免疫保護(hù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 采用分子克隆技術(shù)，從貝氏柯克斯體基因組中克隆P1、Com1、SP34外膜蛋白基因以及HspB基因；將外膜蛋白基因分別與HspB基因融合構(gòu)建了pQE30/pI-htpB、pQE30/coml-htpB、pET28a/htpB-sp34原核表達(dá)質(zhì)粒

3、，原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌分別產(chǎn)生P1-HspB、Com1-HspB、HspB-SP34融合蛋白。免疫印跡分析顯示這些融合蛋白均可以與貝氏柯克斯體感染血清發(fā)生特異性的反應(yīng)，證明其具有良好的抗原反應(yīng)性。 采用親和層析的方法純化P1-HspB、Com1-HspB、HspB-SP34融合蛋白，用它們分別免疫BALB/c小鼠，分析其免疫原性。P1-HspB融合蛋白免疫小鼠不僅產(chǎn)生特異性IgG抗體的水平顯著高于單P1蛋白免疫小鼠，而且γ

4、干擾素和IL-2細(xì)胞因子水平也顯著高于P1單個(gè)蛋白免疫。檢測Com1-HspB和HspB-SP34融合蛋白免疫小鼠后的抗體水平，結(jié)果同樣表明融合蛋白誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的能力顯著好于外膜蛋白單獨(dú)免疫。 將純化的P1-HspB、Com1-HspB、HspB-SP34融合蛋白分別免疫BALB/c小鼠，用貝氏柯克斯體毒株對(duì)免疫小鼠進(jìn)行攻擊，最后用定量PCR分析受攻擊小鼠脾臟的貝氏柯克斯體載量。多次試驗(yàn)的結(jié)果顯示融合蛋白免疫小鼠的貝氏

5、柯克斯體攻擊后脾臟荷菌量顯著低于單獨(dú)外膜蛋白免疫小鼠，說明熱休克融合蛋白P1-HspB、Com1-HspB、HspB-SP34的免疫保護(hù)效果明顯好于P1、Com1、SP34、HspB單獨(dú)免疫。 結(jié)論：貝氏柯克斯體膜表面蛋白與熱休克蛋白B融合后產(chǎn)生的P1-HspB、Com1-HspB、HspB-SP34融合蛋白的免疫原性和免疫保護(hù)性顯著強(qiáng)于單個(gè)外膜蛋白，說明熱休克蛋白B具有顯著的免疫增強(qiáng)作用。P1-HspB、Com1-HspB、H