人臍帶間充質(zhì)干細胞來源的微囊通過miR-30抑制線粒體碎裂減輕急性腎臟缺血再灌注損傷的機制研究.pdf

1、目的：
　　探討人臍帶間充質(zhì)干細胞（human Wharton-Jelly mesenchymal stromal cells,hWJ-MSC）來源的微囊（extracellular vesicles,EVs）對大鼠腎急性缺血再灌注損傷的治療作用，并進一步探索線粒體動力學相關的機制研究。
　　方法：
　　從人臍帶內(nèi)分離出臍帶間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)至3-6代后分別用miR-30b/c/d抑制劑處理24小時，更換正常培養(yǎng)基后再

2、無血清處理24小時，收集其條件培養(yǎng)基（conditional medium），運用差速離心法分離提純微囊，并做蛋白定量。8周齡SD大鼠分為假手術組、損傷組、EV治療組、EVs+miR抑制劑對照組和EVs+miR-30b/c/d抑制組共8組，并建立單側(cè)腎缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）模型（右腎切除，左腎缺血45分鐘后再灌注）；EV治療組、miR抑制劑對照組和miR-30b/c/d抑制組再灌

3、注時立即通過尾靜脈注射100ugEVs，損傷組注射同樣體積的M199細胞培養(yǎng)液。在再灌注24小時后，取腎臟及血液標本進行檢測。
　　腎臟組織內(nèi)細胞總線粒體分裂蛋白(Dynamin-related protein,DRP1)和線粒體DRP1表達情況應用Western-blot進行評估；腎組織內(nèi)和臍帶干細胞來源的微囊內(nèi) miR-30b/c/d表達以及 miR抑制劑的效用檢測應用qRT-PCR進行評估；微囊在腎組織內(nèi)的追蹤通過免疫熒光進

4、行評估；腎小管上皮凋亡應用caspase-9免疫組化及TUNEL染色法進行評估；腎功能通過檢測血清肌酐（Scr）、尿素氮(BUN)濃度進行評估。
　　體外實驗，培養(yǎng)SD大鼠腎小管上皮原代細胞，以疊氮化鈉NaN3處理腎小管上皮細胞建立體外缺血再灌注損傷模型，損傷后給予 EVs或miR抑制劑處理后的EVs治療。應用MitoTracker Red CMXRos熒光標記上皮細胞線粒體，通過激光共聚焦顯微鏡成像評估線粒體動態(tài)平衡（mitoc

5、hondrial dynamics）。
　　結果：
　　體內(nèi)實驗中，在缺血再灌注條件下，腎臟組織內(nèi)miR-30b/c/d明顯降低，細胞總DRP1無明顯改變，而線粒體DRP1表達增高，小管上皮細胞凋亡增高，caspase-9表達增多，血清肌酐、尿素氮升高；經(jīng)EVs治療后，腎臟組織內(nèi)miR-30b/c/d表達恢復，線粒體DRP1下降，小管上皮凋亡減輕，caspase-9表達減少，血清肌酐、尿素氮降低，腎損傷減輕；而在miR抑制劑

6、處理過的EVs治療組中，EVs治療效果明顯下降。
　　體外實驗中經(jīng)過缺氧受損的腎小管上皮細胞內(nèi)線粒體動態(tài)平衡被打破，傾向分裂，EVs治療后線粒體動態(tài)平衡恢復，而miR抑制劑又抑制了這一效應。
　　結論：
　　我們的研究發(fā)現(xiàn)了miR-30和DRP1參與了EVs治療腎臟缺血再灌注損傷的修復機制，EVs能夠通過向腎小管上皮細胞傳遞 miR-30b/c/d來調(diào)控 DRP1，恢復線粒體動態(tài)平衡，從而發(fā)揮抗凋亡作用，減輕腎損傷，保