抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖的表觀遺傳學(xué)藥物篩選及HC toxin對(duì)CCLP-1細(xì)胞的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　肝內(nèi)膽管癌(Intrahepatic Cholangiocarcinoma，ICC)是原發(fā)于肝臟的惡性腫瘤，來(lái)源于次級(jí)膽管遠(yuǎn)端微小膽管的上皮細(xì)胞，其惡性程度很高、預(yù)后差;雖然發(fā)病率不高，約占原發(fā)性肝癌的10％～20％，占所有膽管癌的10％，但近幾十年來(lái)呈上升趨勢(shì)，尤其是西方國(guó)家。目前，手術(shù)仍是主要的治療方法，但是由于其臨床癥狀不明顯，早期診斷很困難，限制了根治性手術(shù)的開(kāi)展，對(duì)于不能手術(shù)的ICC患者，肝臟移植在遠(yuǎn)期效果上

2、還存在很大的爭(zhēng)議。化療方面，膽道腫瘤化療方案多以采用順鉑+吉西他濱療效較好，但對(duì)于ICC還沒(méi)有大型的臨床研究數(shù)據(jù)支持。由于ICC微環(huán)境豐富、異質(zhì)性差別大，而且具有很強(qiáng)的促結(jié)蹄組織增殖能力，這使得其對(duì)一般的化療容易產(chǎn)生耐受性。因此尋找敏感的化療藥物，解決化療耐受性問(wèn)題，對(duì)于治療ICC具有十分重要的意義。
　　表觀遺傳學(xué)機(jī)制主要包含脫氧核糖核酸（DNA）的甲基化、非編碼核糖核酸(RNA)調(diào)節(jié)、組蛋白修飾、基因與蛋白的磷酸化過(guò)程以及溴蛋

3、白結(jié)構(gòu)域修飾等，它們?cè)诃h(huán)境因素影響的疾病中起著很重要的作用，在ICC的病理生理過(guò)程中，多種表觀遺傳學(xué)機(jī)制也發(fā)揮了重要的作用。目前，針對(duì)表觀遺傳學(xué)機(jī)制開(kāi)發(fā)的藥物被認(rèn)為在治療癌癥、心腦血管慢性疾病和精神神經(jīng)等疾病中具有巨大潛力，并且有很多藥物已經(jīng)進(jìn)入各期臨床研究。而應(yīng)用于ICC治療的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究還屬于相對(duì)空白的區(qū)域。因此從表觀遺傳學(xué)位點(diǎn)調(diào)控出發(fā)，開(kāi)發(fā)的表觀遺傳學(xué)藥物在治療ICC方面可能具有很好的前景，而組蛋白去乙?；?Histonede

4、acetylase,HDAC)抑制劑HC toxin(Helminthosporium carbonum toxin, HCtoxin)可能成為其中的一種。
　　近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路的激活可使成熟的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)變成ICC前體細(xì)胞，這使得Notch信號(hào)通路在ICC的發(fā)病機(jī)制上的研究受到極大的關(guān)注，同時(shí)，Notch通路也受到了表觀遺傳學(xué)方面的調(diào)控，尤其是HDAC修飾對(duì)該通路的影響存在不小的爭(zhēng)議，這提示我們?cè)陂_(kāi)發(fā)HDAC相關(guān)類藥物用

5、以治療ICC時(shí)必須考慮其對(duì)Notch通路可能的影響。
　　基于以上研究背景，本課題分為三組實(shí)驗(yàn)，主要目的有三:
　　實(shí)驗(yàn)一:針對(duì)ICC細(xì)胞株，進(jìn)行表觀遺傳學(xué)藥物的篩選，得出對(duì)ICC細(xì)胞較為敏感的藥物，為ICC的新藥物化療提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)二:探討HDAC抑制劑HC Toxin對(duì)ICC細(xì)胞的在增殖、細(xì)胞周期、凋亡等多方面生物學(xué)功能上的影響。
　　實(shí)驗(yàn)三:探討HDAC抑制劑HC Toxin對(duì)ICC細(xì)胞Not

6、ch信號(hào)通路的影響。
　　方法:
　　針對(duì)三組實(shí)驗(yàn)，分別采用以下方法完成
　　實(shí)驗(yàn)一:
　　1.針對(duì)ICC細(xì)胞株RBE，采用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)法，對(duì)Cayman公司提供的表觀遺傳學(xué)藥物文庫(kù)No.11076，進(jìn)行單一時(shí)間點(diǎn)的藥物初步篩選。
　　2.用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)，將上訴初步篩選所得出的敏感藥物以及吉西他濱(Gemcitabine)對(duì)HuCCT1、CCLP-1、TFK-1、RBE等多種ICC細(xì)胞進(jìn)

7、行處理，在多濃度梯度上作抑制效果的比較，并確定其半數(shù)有效抑制率。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　1.用細(xì)胞計(jì)數(shù)法及平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)HC Toxin對(duì)ICC細(xì)胞系CCLP-1增殖及克隆形成能力的影響。
　　2.用光學(xué)顯微鏡下觀察吉姆薩染色前后HC Toxin對(duì)ICC細(xì)胞CCLP-1的形態(tài)學(xué)影響，探索該過(guò)程中可能的生物學(xué)過(guò)程。
　　3.用7-AAD染色的流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)ICC細(xì)胞CCLP-1經(jīng)HC toxin處理一定

8、時(shí)間后的細(xì)胞周期的分布，探索HC toxin對(duì)ICC細(xì)胞周期的影響。
　　4.用AnnexinⅤ FITC和7-AAD聯(lián)合染色的流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)ICC細(xì)胞CCLP-1經(jīng)HC toxin處理一定時(shí)間后細(xì)胞的凋亡情況，探索HC toxin對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　實(shí)驗(yàn)三:
　　1.用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)ICC細(xì)胞CCLP-1經(jīng)HC toxin處理一定時(shí)間后Notch1等部分重要基因轉(zhuǎn)錄情況變化。<

9、br>　　2.用細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)(Immunofluorescence，IF)及蛋白免疫印跡法(Western Blot)，檢測(cè)ICC細(xì)胞CCLP-1經(jīng)HC toxin處理一定時(shí)間后Notch通路相關(guān)蛋白notch1、Hes1等的表達(dá)變化。
　　3.用CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)法，檢測(cè)Notch通路抑制劑DAPT單獨(dú)或聯(lián)合HCtoxin對(duì)CCLP-1的細(xì)胞活力的影響。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:
　　1.所選表觀遺傳學(xué)

10、文庫(kù)共有95種表觀遺傳學(xué)藥物，其中27 uM的高濃度藥物作用下，有22種表觀遺傳學(xué)藥物對(duì)RBE細(xì)胞有抑制作用，包括HDAC抑制劑12種(HCToxin, TSA, SAHA,4-iodo-SAHA, SB939, CAY10398, M344, ITF2257，Oxamflatin，Scriptai，CBHA，CAY10603);組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑3種(Chaetocin，GSK343，BIX01294);組蛋白去甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制

11、劑2種(PFI-1，GSK-J4);磷酸化抑制劑2種（Bromosporine，JQ1）;溴蛋白結(jié)構(gòu)域抑制劑1種（phthalazinone pyrazole）;DNA甲基化酶抑制劑1種(Neplanocin A);而在3uM藥物濃度下對(duì)RBE細(xì)胞仍具有強(qiáng)烈抑制作用的有HC Toxin，TSA，SAHA，4-iodo-SAHA及Chaetocin，其中前4種均為HDAC抑制劑。
　　2.對(duì)HC Toxin，TSA，SAHA和吉西他

12、濱(Gemcitabine，GEM)進(jìn)行多種細(xì)胞株、多濃度梯度的藥效比較，發(fā)現(xiàn)HC toxin的抑制作用均較TSA、SAHA、TSA、GEM等強(qiáng)烈，其次是TSA、而GEM最弱。其中，HC toxin對(duì)CCLP-1，HuCCT1，TFK-1，RBE的半數(shù)有效抑制率，分別為297.6+80.4 nM，520.0+43.0 nM，854.6+86.9 nM,713.7+27.3 nM。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　1.細(xì)胞計(jì)數(shù)表明:HC t

13、oxin能抑制CCLP-1細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)一定的濃度與時(shí)間依賴性。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明:經(jīng)不同濃度HC toxin處理后，細(xì)胞克隆形成能力減弱，在HC toxin濃度大于100 nM時(shí)與藥物濃度呈正相關(guān)，50 nM以內(nèi)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.用光學(xué)顯微鏡觀察吉姆薩染色前后的CCLP-1形態(tài)變化顯示，經(jīng)HC toxin處理48小時(shí)后出現(xiàn):①細(xì)胞密度變小，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞質(zhì)成分減少，分裂像減少;②部分細(xì)胞變圓脫落，帶凋亡小體的細(xì)

14、胞明顯增多，而細(xì)胞脹大破裂者少見(jiàn);③樹(shù)突狀結(jié)構(gòu)。計(jì)算出現(xiàn)凋亡小體的細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)HC toxin引起細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體與HC toxin濃度呈正相關(guān)關(guān)系。
　　3.7-AAD染色的流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組經(jīng)HC toxin處理48小時(shí)后，G0/G1期細(xì)胞比例明顯上升，G2/M期細(xì)胞比例明顯下降，呈現(xiàn)濃度依賴性，而S期細(xì)胞比例變化不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.AnnexinⅤ FITC聯(lián)合7-AAD染色的流式細(xì)胞技術(shù)

15、實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)HC toxin處理48小時(shí)后早期凋亡、晚期凋亡及總凋亡的細(xì)胞比例均明顯增多，呈現(xiàn)濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.Western blot實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)HC toxin處理48小時(shí)后，CCLP-1細(xì)胞中某些凋亡相關(guān)蛋白cytochrome c、bax/bcl-2的相對(duì)表達(dá)量在各個(gè)濃度組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，caspase3在HC toxin濃度為400 nM時(shí)較對(duì)照組有增加，而其他實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照

16、組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)三:
　　1.RT-qPCR檢測(cè)表明經(jīng)HC-Toxin處理一段時(shí)間后，CCLP-1中Notch1等6個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了一定的改變。STAT3等10個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.Immunofluorescence實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)表明，HC toxin處理CCLP-1細(xì)胞后，Notch通路被激活，Notch通路相關(guān)蛋白Notch1、Hes1表達(dá)量明顯增加，并

17、呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。
　　3.CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試驗(yàn)顯示，Notch通道阻滯劑DAPT濃度低于50uM時(shí)對(duì)CCLP-1細(xì)胞無(wú)明顯的抑制作用，但可以明顯增強(qiáng)200 nM HC toxin對(duì)CCLP-1細(xì)胞活力的抑制作用，當(dāng)DAPT大于50uM時(shí)對(duì)CCLP-1細(xì)胞具有明顯的抑制作用，并與HC toxin呈現(xiàn)協(xié)同作用.
　　結(jié)論:
　　1.多種表觀遺傳學(xué)藥物在體外能對(duì)ICC細(xì)胞RBE具有強(qiáng)烈的抑制作用，其中HDAC抑制劑尤為

18、突出，提示HDAC有可能是抑制RBE細(xì)胞增殖的敏感靶位，但證據(jù)還不夠充分。
　　2.HC toxin對(duì)多種ICC細(xì)胞具有強(qiáng)烈的抑制作用，效果比其他HDAC抑制劑和吉西他濱強(qiáng)烈，并呈現(xiàn)一定的濃度與時(shí)間依賴性。其對(duì)ICC細(xì)胞的作用是綜合的，多方面的，與抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有一定關(guān)系。
　　3.HC toxin對(duì)CCLP-1細(xì)胞活力既有抑制作用也有促進(jìn)作用，抑制作用大于促進(jìn)作用，促進(jìn)作用可能與HC toxin激