人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞阻抑肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞生長的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)，又被稱為外周型膽管癌，或者膽管癌之肝內(nèi)型，它是肝內(nèi)膽管被覆上皮發(fā)生的，并起源于肝內(nèi)二級(jí)分支以下膽管上皮的原發(fā)性肝癌的其中一種類型，據(jù)世界范圍內(nèi)統(tǒng)計(jì)，ICC約占原發(fā)性肝臟所發(fā)生惡性腫瘤的10％-15％，其發(fā)生率僅次于肝細(xì)胞癌(HCC)，但近年來已經(jīng)上升為肝內(nèi)原發(fā)腫瘤導(dǎo)致死亡的第一位，目前認(rèn)為，肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生與膽管結(jié)石、乙

2、型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎感染以及其他膽管發(fā)生的炎癥等因素密切相關(guān)。肝內(nèi)膽管癌具有發(fā)生隱匿、臨床癥狀不典型、惡性程度高、發(fā)展迅速、容易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，盡管目前在早期診斷和治療方法上有了很大改進(jìn)，但是仍不能改變其不良預(yù)后，因此發(fā)現(xiàn)新的、有效的抗肝內(nèi)膽管癌的方法是當(dāng)務(wù)之急。隨著廣大研究者對(duì)腫瘤分子機(jī)制不斷的深入認(rèn)識(shí)，現(xiàn)在已將惡性腫瘤定義為一種多因子、多步驟和多基因參與的全身性疾病，因此，在近10年中，腫瘤的生物學(xué)治療以及基因治療成為腫瘤治療的

3、研究熱點(diǎn)和新希望。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是干細(xì)胞的一種類型，因其能分化成間質(zhì)組織而得名，MSCs是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)環(huán)境下，可進(jìn)一步分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉等組織，目前，MSCs已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療及組織再生方面的研究。人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞因較其他來源的干細(xì)胞具有更明顯的優(yōu)勢，所以越來越受到人們的重視，研究表明，人臍帶組織中分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞既具有較強(qiáng)的增殖能力，又具有向其

4、它類型細(xì)胞（神經(jīng)元樣細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞等）分化的能力，加之其來源廣泛、易獲得且具有較強(qiáng)的腫瘤趨化能力等特點(diǎn)，在細(xì)胞移植及基因治療、組織工程等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。因干細(xì)胞強(qiáng)的腫瘤趨化能力，很多研究者聚焦于其與腫瘤細(xì)胞之間的關(guān)系，干細(xì)胞移植技術(shù)已應(yīng)用于幾種造血及非造血腫瘤的治療，將干細(xì)胞應(yīng)用于腫瘤治療具有廣泛的前景，有研究證實(shí)，某些實(shí)體腫瘤的生長可被干細(xì)胞所抑制，另有研究顯示，這種抑制作用是通過于細(xì)胞自身分泌的可

5、溶性活性因子實(shí)現(xiàn)的。
　　但是，目前尚沒有關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞作用研究的相關(guān)報(bào)道，因此本研究對(duì)此作用及其分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討。本研究通過Transwell共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、MTT比色實(shí)驗(yàn)、DNA斷裂實(shí)驗(yàn)等方法，檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞增殖和凋亡的影響，同時(shí)借助于WesternBlot及免疫熒光染色方法，檢測與肝內(nèi)膽管癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)通路中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作用于

6、肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞生長可能的分子機(jī)制。
　　第一部分:人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞生長的影響
　　研究目的:
　　1、檢測人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞生長的影響。
　　2、檢測不同濃度人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞生長的影響。
　　3、檢測人類臍帶間充干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞生長的影響是否由誘導(dǎo)HCCC-9810細(xì)胞凋

7、亡所介導(dǎo)。
　　4、檢測人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及其條件培養(yǎng)基對(duì)裸鼠肝內(nèi)膽管癌移植瘤生長的影響。
　　研究方法:
　　1、采用transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)共培養(yǎng)人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUVECs細(xì)胞作為對(duì)照）與HCCC-9810細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)處理后的腫瘤細(xì)胞數(shù)。
　　2、配置不同濃度的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(10％、25％、50％、75％)處理HCCC-9810細(xì)胞，應(yīng)用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)測定HCC

8、C-9810細(xì)胞增殖率的變化。
　　3、應(yīng)用Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)檢測干細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)HCCC-9810細(xì)胞凋亡的作用。
　　4、采用皮下注射細(xì)胞懸液的方法，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，測量注射不同細(xì)胞組間腫瘤發(fā)生率及體積大小，并采用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基注射于已形成腫瘤部位的方法，測量腫瘤體積的變化。
　　5、采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義通過獨(dú)立組間學(xué)生t檢驗(yàn)，采用

9、((x)±S)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞增殖的影響
　　HCCC-9810細(xì)胞與hUC-MSCs細(xì)胞共培養(yǎng)48h后，計(jì)數(shù)細(xì)胞為7.64×105個(gè)/ml，而與HUVECs細(xì)胞共培養(yǎng)48h后，細(xì)胞計(jì)數(shù)為11.98×105個(gè)/ml，由此可見，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的HCCC-9810腫瘤細(xì)胞抑制效應(yīng)明顯高于HUVECs對(duì)照組，與對(duì)照組相比，腫瘤細(xì)胞增殖率下降了34.4％，

10、差異具明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。為了進(jìn)一步檢測培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境是否能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，我們檢測了干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)HCCC-9810細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，HCCC-9810細(xì)胞經(jīng)不同濃度間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液處理后，細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)時(shí)間與劑量依賴性，HCCC-9810細(xì)胞經(jīng)50％間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，增殖抑制率由6.21％增至49.86％，與對(duì)照組相比有顯著差距。我們又采用了細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步

11、證實(shí)這種抑制作用的存在，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組細(xì)胞克隆單位形成數(shù)明顯低于對(duì)照組(p＜0.01)。
　　2、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)HCCC-9810細(xì)胞凋亡的影響
　　為了證實(shí)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)HCCC-9810細(xì)胞的增殖抑制是否由凋亡介導(dǎo)，進(jìn)一步采用DNA染色的方法觀察核染色質(zhì)形態(tài)。結(jié)果顯示，HCCC-9810細(xì)胞經(jīng)50％臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液處理48h后，經(jīng)Hoechst3325

12、8染色呈現(xiàn)明顯細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞比率明顯高于對(duì)照組，與對(duì)照組相比，差異具明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05VS.HUVEC對(duì)照組)。
　　3、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抑制BALB/C裸鼠移植瘤的形成
　　結(jié)果顯示，皮下注射不同細(xì)胞組50天后，注射HCCC-9810+MSC細(xì)胞組，移植瘤出現(xiàn)時(shí)間及腫瘤體積均明顯低于對(duì)照組:觀察至第35-40天，有7只裸鼠長出可視腫瘤（觀察至第50天，平均腫瘤體積約為1.3cm3），此組中另外3只裸鼠始終無

13、腫瘤發(fā)生。注射HCCC-9810細(xì)胞組，或者HCCC-9810+HUVEC細(xì)胞組中所有實(shí)驗(yàn)小鼠均形成了可視腫瘤（觀察至第50天，平均腫瘤體積分別為2.6cm3，2.5cm3）。實(shí)驗(yàn)的50-70天，分別給HCCC-9810實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)注射間充質(zhì)干細(xì)胞或者HUVECs細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，注射間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基組，原本已形成的腫瘤體積明顯縮小，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組小鼠腫瘤的平均體積降至1.4cm3，而對(duì)照組腫瘤體積繼續(xù)

14、增長至3.5cm3，差異具顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可抑制肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞的生長。
　　2、經(jīng)50％臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞24小時(shí)可達(dá)到細(xì)胞的半數(shù)抑制率。
　　3、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可抑制BALB/C裸鼠移植瘤的形成，且其條件培養(yǎng)基可使已形成的腫瘤體積縮小。
　　4、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞生長的抑

15、制作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所介導(dǎo)的。
　　第二部分:人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞阻抑肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞生長的分子機(jī)制
　　研究目的:
　　1、檢測經(jīng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用后，肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要蛋白的表達(dá)水平變化。
　　2、檢測經(jīng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基作用后，肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要蛋白的表達(dá)水平變化。
　　3、

16、檢測加入GSK-3β的抑制劑或者激活劑，或加入Akt激活劑，作為單一處理因素，或者聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理HCCC-9810細(xì)胞，所介導(dǎo)的肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞增殖及相關(guān)蛋白的變化。
　　研究方法:
　　1、Western Blot方法檢測肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞經(jīng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理前后p-PI3K、p-PDK1、p-Akt、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β、β-Catenin、c-Myc、Cyc

17、linD1等蛋白的表達(dá)變化。
　　2、細(xì)胞免疫熒光染色方法檢測肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞經(jīng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理前后p-Akt、p-GSK-3β、β-Catenin的表達(dá)變化。
　　3、分別加入GSK-3β特異性激活試劑SNP及特異性抑制試劑CHIR99021作為單一處理因素，或者與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基聯(lián)合作用后，觀察肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞增殖能力變化，并進(jìn)一步檢測β-Catenin的表達(dá)變化。

18、
　　4、加入Akt特異性激活劑IGF-1預(yù)處理HCCC-9810細(xì)胞15min后，進(jìn)一步觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1、hUC-MSCs條件培養(yǎng)基可抑制肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　1)Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCCC-9810細(xì)胞經(jīng)50％hUC-MSCs條件培養(yǎng)基處理48小時(shí)

19、后，與對(duì)照組相比，p-PI3K、p-PDK1、p-Akt、p-GSK-3β的表達(dá)明顯下調(diào)，而總的Akt(T-Akt)與總的GSK-3β(T-GSK-3β)的表達(dá)無明顯變化，而HUVEC條件培養(yǎng)基處理組上述蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組相比無明顯變化。統(tǒng)計(jì)顯示，HUVEC條件培養(yǎng)基處理組與hUC-MSC條件培養(yǎng)基處理組相比，p-Akt與T-Akt的灰度比值分別為0.65±0.04及0.19±0.02(P＜0.001)，p-GSK-3β與T-GSK-

20、3β的灰度比值分別為0.48±0.03及0.22±0.05(P＜0.01)，比值差異均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2)細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組p-Akt、p-GSK-3β的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為37.3±0.8％、35.7±1.2％，空白對(duì)照組p-Akt、p-GSK-3β的蛋白熒光強(qiáng)度明顯高于干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組，兩組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義較顯著(P＜0.01，p-Akt;P＜0.01，p-GS

21、K-3β)。
　　2、hUC-MSCs條件培養(yǎng)基可抑制肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞中Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　1)Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝內(nèi)膽管癌HCCC-9810細(xì)胞經(jīng)50％hUC-MSCs條件培養(yǎng)基處理48小時(shí)后，與空白對(duì)照組相比，β-catenin、c-Myc、cyclin-D1的表達(dá)明顯下調(diào)，并且β-catenin的核富集量明顯減少，而HUVEC條件培養(yǎng)基處理組β-catenin、c-

22、Myc、cyclin-D1的蛋白表達(dá)情況幾乎與空白對(duì)照組相似。
　　2)細(xì)胞熒光免疫染色結(jié)果顯示，干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組β-catenin在細(xì)胞核中熒光強(qiáng)度較空白對(duì)照組明顯減弱。
　　3、hUC-MSCs條件培養(yǎng)基通過Akt通路調(diào)節(jié)GSK-3β的活性，從而下調(diào)β-catenin的表達(dá)，抑制Wnt通路
　　經(jīng)GSK-3β抑制劑(CHIR99021)處理后，48h觀察點(diǎn)結(jié)果顯示，CHIR99021與hUC-MSCs條件培養(yǎng)

23、基聯(lián)合處理組與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基單獨(dú)處理組相比，HCCC-9810細(xì)胞的抑制作用明顯減弱(p＜0.001)，并且CHIR99021與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基聯(lián)合處理組增加了β-catenin的蛋白表達(dá)水平。而經(jīng)GSK-3β激活劑(SNP)處理后，48h觀察點(diǎn)結(jié)果顯示，SNP與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基聯(lián)合處理組與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基單獨(dú)處理組相比，HCCC-9810細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)(p＜0.001)，并且SNP與h

24、UC-MSCs條件培養(yǎng)基聯(lián)合處理組下調(diào)了β-catenin的蛋白表達(dá)水平。加入Akt通路激活劑IGF-1預(yù)處理HCCC-9810細(xì)胞15min后，24h觀察點(diǎn)結(jié)果顯示，IGF-1與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基聯(lián)合處理組與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基單獨(dú)處理組相比，IGF-1與hUC-MSCs條件培養(yǎng)基聯(lián)合處理組對(duì)HCCC-9810細(xì)胞的抑制作用明顯下降(p＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、hUC-MSCs條件培養(yǎng)基可通過抑制P