“發(fā)熱伴血小板減少綜合征”病毒傳播媒介及宿主調(diào)查研究.pdf

1、2010年5月經(jīng)中國疾病預(yù)防與控制中心病毒病所專家證實(shí)，在一類以“發(fā)熱伴血小板減少綜合征”為主要臨床表現(xiàn)的患者血清中發(fā)現(xiàn)了一種新型布尼亞病毒，并命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)。該病毒屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，白蛉病毒屬(Phlebovirus)，病毒顆粒呈球形，直徑80-100nm，外有

2、脂質(zhì)包膜，表面有棘突?；蚪M包含三個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段（L、M和S），L片段全長為6368nt，包含單一讀碼框架編碼RNA依賴的RNA聚合酶;M片段全長為3378nt，包含單一讀碼框架編碼1073個(gè)氨基酸的糖蛋白前體;S片段全長為1744nt，為一雙義RNA，基因組以雙向的方式分別編碼病毒核蛋白NP和非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。病毒基因組兩端的11個(gè)堿基序列呈高度保守，與白蛉病毒屬其他病毒成員相同，可形成鍋柄狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)[1]。已知的其他的布尼亞

3、病毒科病毒抵抗力弱，不耐酸、易被熱、乙醚、去氧膽酸鈉和常用消毒劑及紫外線照射等迅速滅活[2]。
　　 目前已在河南、湖北、山東、安徽、遼寧、江蘇等省發(fā)現(xiàn)該病病例，主要分布在以上省份的山區(qū)和丘陵地帶的農(nóng)村，呈高度散發(fā)。本病多發(fā)于春、夏季，不同地區(qū)可能略有差異。人群普遍易感，在丘陵、山地、森林等地區(qū)生活、生產(chǎn)的居民和勞動(dòng)者以及赴該類地區(qū)戶外活動(dòng)的旅游者感染風(fēng)險(xiǎn)較高，傳播途徑尚不明確，部分病例有明確的蜱叮咬史。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，接觸危

4、重病人急性期血液具有人傳人的可能性，應(yīng)引起患者家屬和衛(wèi)生工作者的重視，做好個(gè)人防護(hù)[2]。布尼亞病毒在自然界的傳播-循環(huán)的模式主要有兩種:1、以Lacrosse病毒為例，其在自然界中主要傳播媒介為蚊蟲，主要擴(kuò)增宿主為小型嚙齒動(dòng)物（松鼠、花栗鼠等），雌蚊可通過卵將病毒傳播給下一代，這也是Lacrosse病毒過冬的主要機(jī)制;此外，通過交配的方式雄蚊可將病毒傳播給雌蚊，引起在蚊種群中的擴(kuò)散;感染的蚊蟲通過叮咬小型嚙齒動(dòng)物，在動(dòng)物體內(nèi)引起病毒血

5、癥，其他蚊蟲叮咬被感染的動(dòng)物引起該病毒進(jìn)一步擴(kuò)散，感染的蚊蟲叮咬人，可在人群中引起疾病。2、以漢坦病毒為例，該類病毒主要通過嚙齒動(dòng)物進(jìn)行傳播，主要有水平傳播（撕咬、糞、尿和氣溶膠），垂直傳播（感染的雌鼠將病毒傳播給子代），人接觸感染性的糞、尿、氣溶膠或被咬傷也可導(dǎo)致感染[3]。除流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)部分病例有蜱叮咬史之外，SFTS病毒在自然界的傳播-循環(huán)模式尚不清楚。
　　 本研究中，采集疫區(qū)的媒介標(biāo)本，以及動(dòng)物血清，對(duì)標(biāo)本中病毒R

6、NA的含量、動(dòng)物血清中的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，從陽性標(biāo)本中分離病毒，并進(jìn)行全基因組序列測(cè)定。通過同源性比較、系統(tǒng)發(fā)育分析、病毒體外復(fù)制特性比較、抗原性比較等不同方面闡釋蜱、羊和狗，作為該新型病毒媒介和宿主的可能性。此外，開展理化特性實(shí)驗(yàn)和藥敏實(shí)驗(yàn)，以期對(duì)該新型病毒生物學(xué)特性有較全面的研究，為進(jìn)一步開展相關(guān)工作提供基礎(chǔ)資料。
　　 [研究目的]：
　　 1.探索“發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒”在傳播媒介及宿主中的流行情況;

7、r>　　 2.分析比較該病毒的病原學(xué)和分子生物學(xué)特征;
　　 3.了解該病毒的生物學(xué)特性，為開展相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　 [研究方法]：
　　 1.采集疫區(qū)的蜱和家畜血清標(biāo)本，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和雙抗體夾心法ELISA及間接免疫熒光法(IFA)，檢測(cè)媒介和動(dòng)物血清中發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒RNA和動(dòng)物血清中特異抗體;
　　 2.病毒RNA檢測(cè)陽性的標(biāo)本，采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離病毒，并通過間接免疫

8、熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定;
　　 3.通過RT-PCR方法，對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)陽性標(biāo)本和分離毒株進(jìn)行序列測(cè)定，并進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析;
　　 4.通過生長動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，觀察該病毒的復(fù)制特性，通過交叉中和實(shí)驗(yàn)和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，比較不同標(biāo)本中分離得到的病毒株的抗原特性差異;
　　 5.通過滅活實(shí)驗(yàn)，探索該病毒的滅活條件;
　　 6.開展理化特性研究，觀察該病毒對(duì)不同理化因素的敏感性;
　　 7.通過藥

9、敏實(shí)驗(yàn)，觀察利巴韋林對(duì)該病毒的體外抑制效果。
　　 [結(jié)果]：
　　 1.標(biāo)本采集和SFTS病毒核酸檢測(cè):共采集山東蓬萊、萊州2市22戶病人及鄰居家畜寄生蜱140頭，主要采自牛、羊、狗三種動(dòng)物，動(dòng)物帶蜱率100％（帶蜱率=帶蜱數(shù)/檢查動(dòng)物數(shù)）。經(jīng)分類鑒定，所采蜱主要從屬于3屬3種，分別為血蜱屬（長角血蜱、扇頭蜱屬血紅扇頭蜱以及草皮屬森林革蜱，其中長角血蜱為優(yōu)勢(shì)蜱種，構(gòu)成比為91.4％，森林革蜱和血紅扇頭蜱分別占5％、3.

10、6％。對(duì)蜱研磨液進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR結(jié)果顯示，SFTS病毒核酸陽性3頭，均為長角血蜱，其中2頭采自病人家庭飼養(yǎng)的狗體表，1頭采自羊體表。蜱最小感染率為2.14％(最小感染率=陽性組數(shù)/蛑總數(shù)×100％)，蚊標(biāo)本研磨液未檢測(cè)到病毒RNA。共采集動(dòng)物血液標(biāo)本106份，其中牛血清21份、羊血清50份、狗血清35份，其病毒RNA陽性率分別為4.7％、6％、2.8％。
　　 2.SFTS病毒抗體檢測(cè):共采集動(dòng)物血液標(biāo)本106份，其中牛血

11、清21份、羊血清50份、狗血清35份，ELISA檢測(cè)的總抗體陽性率分別為0％、60％、19％，間接免疫熒光檢測(cè)的抗體陽性率分別為0％、60％、19％。
　　 3.病毒分離及鑒定:SFTS病毒核酸檢測(cè)陽性的標(biāo)本，經(jīng)連續(xù)三代細(xì)胞分離培養(yǎng)，通過SFTS病毒核酸檢測(cè)和間接免疫熒光檢測(cè)法鑒定，從采自山東萊州的蜱研磨液、狗血清以及羊血清中各分離到一株病毒。
　　 4.序列測(cè)定及比對(duì)分析:將從蜱研磨液、狗血清以及羊血清中分離的毒株，進(jìn)

12、行全序列測(cè)定，從蜱中分離的毒株的序列與病人血清中分離的毒株核酸序列S、M、L片段的同源性分別為94.9％-99.3％，95.2％-99.6％，95.9％-98.9％;從羊血清標(biāo)本中分離的毒株與病人血清中分離的毒株核酸序列S、M、L片段的同源性分別為95.2％-100％，95.6％-98.1％，96％-98.1％;從狗血清標(biāo)本中分離的毒株與病人病人血清中分離的毒株核酸S、M、L片段的同源性分別為94.8％-98.2％，95.9％-97.5

13、％，95.9％-98.1％;通過系統(tǒng)發(fā)育分析，未發(fā)現(xiàn)各毒株之間有明顯的聯(lián)系，不同省份分離到的毒株聚為一類，沒有明顯的地域特征。
　　 5.病毒生長動(dòng)態(tài):通過觀察該病毒的復(fù)制特性，未發(fā)現(xiàn)蜱源病毒株和人源病毒株的生長趨勢(shì)有明顯差別，第1-3天，病毒復(fù)制緩慢，第5-7天病毒進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第7-10天病毒達(dá)到生長平臺(tái)期，病毒滴度可達(dá)3*107(TCID50/ml)。
　　 6.病毒抗原性比較:通過間接免疫熒光法和交叉中和試驗(yàn)檢

14、測(cè)，未發(fā)現(xiàn)從人、羊、狗、蜱不同標(biāo)本分離的毒株與相同恢復(fù)期血清反應(yīng)的抗體滴度有明顯差異，均在4倍以內(nèi)。這提示不同標(biāo)本中分離的毒株在抗原性無明顯差異。
　　 7.SFTS病毒生物學(xué)特性:通過理化特性分析，該病毒在60℃水浴30min、福爾馬林(1∶2000)、β-丙內(nèi)酯(1∶4000)條件下即可完全滅活，對(duì)熱、乙醚、氯仿、紫外RNAH3、丙酮等理化因素敏感，并通過藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利巴韋林能體外有效抑制病毒的復(fù)制。
　　 [結(jié)論]

15、：
　　 1.通過病毒RNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該病毒核酸在蜱和動(dòng)物血清中都有檢出，并且病毒抗體在動(dòng)物中有較高的陽性率，提示該病毒在當(dāng)?shù)丨h(huán)境中廣泛存在。
　　 2.首次在長角血蜱、羊血清和狗血清中分離到病毒，從病原學(xué)上證實(shí)蜱和羊、狗做為該新型病毒傳播媒介和宿主的可能性;在牛、羊、狗血清中均檢測(cè)到該病毒的特異性抗體，從血清學(xué)上證實(shí)其作為宿主的可能性。
　　 3.將從長角血蜱、羊血清、狗血清和人血清中分離到毒株進(jìn)行全序列測(cè)定，