J亞群禽白血病病毒受體作用域鑒定及其在不同品種雞中的比較研究.pdf

1、J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒（Subgroup J avian leukosis virus, ALV-J）所引起的禽類造血組織中某些細(xì)胞成分過(guò)度增生的腫瘤性疾病。近些年來(lái)， ALV-J在我國(guó)本地雞群中大規(guī)模流行，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程，首先是病毒囊膜蛋白與病毒細(xì)胞受體相互識(shí)別，發(fā)生相互作用，進(jìn)而在受體介導(dǎo)下病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。不同亞群的病毒，其細(xì)胞受體并不相同。據(jù)報(bào)道，禽Ⅰ型 Na+/H+交換蛋白（Ch

2、icken Na+/H+ exchanger typeⅠ， chNHE1）為 J亞群禽白血病病毒的細(xì)胞受體。NHE1基因?yàn)榭醇一颍瑥V泛存在于真核動(dòng)物細(xì)胞膜上。在低pH條件下，ALV-J的囊膜蛋白與chNHE1識(shí)別，跨膜區(qū)（Transmembrane， TM）發(fā)生構(gòu)象改變，促使囊膜蛋白與細(xì)胞膜融合，最終病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。病毒與其受體的結(jié)合是病毒進(jìn)入乃至感染過(guò)程的第一步，具有至關(guān)重要的作用。對(duì)于病毒與受體相互作用過(guò)程的研究，有利于探索病毒感

3、染和致病機(jī)制。因而，本研究致力于探索 ALV-J的細(xì)胞受體 chNHE1的關(guān)鍵作用域及其在不同地方品種雞之間的保守性。
　　首先通過(guò)融合表達(dá)分泌信號(hào)肽的方式實(shí)現(xiàn)了 gp85蛋白的高效可溶性表達(dá)，進(jìn)而建立了檢測(cè)受體結(jié)合能力的流式細(xì)胞分析方法。同時(shí)，構(gòu)建并成功拯救了一株帶有 Luciferase標(biāo)記、囊膜蛋白屬于 ALV-J的 RCAS病毒，并利用此重組病毒建立了檢測(cè)病毒進(jìn)入水平的實(shí)驗(yàn)方法。在此基礎(chǔ)性上，進(jìn)行了 chNHE1與人 NH

4、E1相應(yīng)膜外環(huán)（Extracellular loop， ECL）及與無(wú)關(guān)標(biāo)簽 HA的替換，通過(guò)受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和病毒進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ECL1和ECL3為影響受體功能的關(guān)鍵膜外環(huán)。對(duì)ECL1進(jìn)行逐級(jí)分段替換，證實(shí)了第28-39位氨基酸為影響受體功能的最小區(qū)段。對(duì)這一區(qū)段的12個(gè)氨基酸進(jìn)行了點(diǎn)突變，最終確定30，33，34，38和39五個(gè)位點(diǎn)為影響受體功能的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。與此同時(shí)，通過(guò)對(duì)ECL3進(jìn)行分段替換，確定了214/215兩個(gè)位點(diǎn)協(xié)同作用

5、，影響受體結(jié)合能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所鑒定關(guān)鍵氨基酸的重要作用，以人 NHE1為骨架，替換為chNHE1上相應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)及區(qū)段。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第28-39區(qū)段能使人 NHE1獲得結(jié)合 gp85蛋白能力。這一結(jié)果進(jìn)一步證明了28-39位氨基酸是chNHE1結(jié)合gp85蛋白的關(guān)鍵作用域。
　　流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同地方品種雞之間 ALV-J感染率差異顯著。為了驗(yàn)證這種差異是否是由于 chNHE1作用域發(fā)生了變異，本研究從四個(gè)養(yǎng)禽大省選擇了