miRNA骨架內置siRNA干擾J亞群禽白血病病毒復制.pdf

1、J亞群禽白血病(subgroup J of avian leukosis virus)是由反轉錄病毒科的J亞群禽白血病病毒引起的以髓細胞瘤和其他細胞惡性腫瘤為特征的傳染性腫瘤性疾病。J亞群禽白血病病毒（ALV-J）的基因排列順序從5'端至3'端依次為LTR-leader-gag-pol-env-leader-LTR，主要含有gag、pol、env三個結構基因及結構基因兩側的長末端序列(long terminal repeats，LTR)

2、。
　　近年來，雖然各檢測技術有所提高，但因一些條件限制，該病對我國的危害依然很大。由于亞群間各毒株比較相近，但不同遺傳特征的病毒引起的不同腫瘤的潛伏期不同，所以目前尚無有效防治J亞群禽白血病的方法;由于ALV-J的垂直傳播性、先天感染的免疫耐受雞是主要的傳染源，目前也無可用的疫苗，所以應該另尋方法，靶向于病毒找尋攻克這一難題的方法。
　　RNA干擾(RNA interfrence，RNAi)，是由21 nt～23 nt的雙

3、鏈RNA(Double strandedRNA，dsRNA)引起的同源的內源性mRNA降解，從而導致基因表達沉默的現象，所以為了更好的減輕ALV-J帶給養(yǎng)禽業(yè)的損失，探索利用RNAi技術去解決這一難題。
　　通過比較ALV-J不同毒株的同源性，針對ALV-J NX0101毒株的gag基因中p15編碼區(qū)、pol基因中p32編碼區(qū)、env中gp85編碼區(qū)及LTR基因中的U3編碼區(qū)中同源性較高的區(qū)域篩選到4對siRNA，設計將siRNA

4、置于miRNA骨架結構中，人工合成，將其克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表達載體中，構建了miRNA干擾表達質粒，分別命名為:p-miR-gag、p-miR-pol、p-miR-env、p-miR-LTR和p-miR-mock（陰性對照），進行單獨干擾和聯合干擾，將其轉染105.2 TCID50 ALV-J(NX0101)感染的DF-1細胞，利用IFA，Western-blot和Real-time PCR方法分別

5、在蛋白水平和核酸水平上檢測表達質粒抑制ALV-J復制效果。將質粒與病毒腹腔接種1日齡SPF雛雞，隔日采棉拭子，檢測ALV-J p27，對其排毒情況進行監(jiān)測，每6天采血，分離血清，對其進行抗體檢測，分別在2周齡和4周齡時剖殺5只/組，通過血液學檢測、大體病變和組織學病變方面評估m(xù)iRNA干擾表達質粒在體內的抗病毒效果，進而分析其在臨床上的使用價值。
　　細胞中抗病毒實驗結果表明:(1)4個表達質粒能使靶基因的mRNA和囊膜蛋白的表達

6、水平顯著降低，與陰性對照和空載體對照相比，p-miR-gag、p-miR-pol、p-miR-env、p-miR-LTR重組表達干擾質粒在DF-1細胞中對ALV-J核酸抑制率分別為:83％、78％、85％、74％;(2) p-miR-LTR與其他三種p-miR-gag、p-miR-pol、p-miR-env干擾質粒聯合轉染接毒細胞，利用IFA，Western-blot和Real-time PCR方法分別檢測其對ALV-J在DF-1細胞中

7、復制的影響。聯合干擾后，p-miR-gag+LTR、p-miR-pol+LTR、p-miR-env+LTR對ALV-J的抑制更有效，核酸抑制率分別為:98％、98％和96％，由此顯示，聯合干擾對病毒的抑制具有協同作用，可以更顯著的抑制病毒的增殖。體內抗病毒結果:(1)對各組雞棉拭子ALV-J p27檢測顯示，與ALV-J接毒組和空載體mock組相對比，所有重組質粒干擾組感染初期(1-10d)有效的抑制了病毒的增殖，其S/P值基本都在臨界

8、值之下，后期各重組質粒干擾組排毒有升高趨勢，但均低于陽性對照組，單獨與聯合干擾組干擾效果差異不顯著;(2)血液學檢測顯示，干擾組的白細胞數，淋巴細胞數均接近正常值;(3)病理組織學觀察發(fā)現，ALV-J接毒組的腎臟、肝臟等器官有淋巴細胞增生灶，腦、肺臟出血，法氏囊萎縮，而重組表達干擾質粒組只有部分器官呈現少許的炎性細胞的浸潤，聯合干擾組大體剖檢及病理學檢測無明顯病變。
　　由此看出本實驗所篩選到的4對siRNA在體外細胞和動物體內都