家蠶短散在重復(fù)元件BmSer_SINE的鑒定和功能研究.pdf

1、家蠶作為一種能吐絲結(jié)繭的重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，是由野桑蠶馴化而來(lái)的。絲腺是家蠶泌絲器官，家蠶發(fā)育到五齡以后開(kāi)始大量合成絲蛋白形成繭殼，總計(jì)合成大約0.5g。家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立以后，如何利用絲腺作為生物反應(yīng)器高效的合成外源蛋白成為研究者研究的焦點(diǎn)。蠶絲主要成分是絲素和絲膠，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)與輕鏈絲素融合表達(dá)的外源蛋白需要高鹽高變性劑才能純化，其原因是絲素蛋白不溶于水。但同為繭絲蛋白的絲膠卻是溶于水的，絲膠蛋白在清水中溶解特性表明絲膠1蛋白最先溶解

2、出來(lái)，也是含量最多的蛋白。本研究在于克隆家蠶絲膠l基因啟動(dòng)子，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在中部絲腺特異表達(dá)可以分泌到繭殼中的外源蛋白。在克隆絲膠1基因啟動(dòng)子時(shí)，利用大造品系基因組克隆絲膠1基因啟動(dòng)子，得到的產(chǎn)物大小與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄序列一致，而利用N4品種基因組克隆得到的產(chǎn)物大小要比GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄序列小449個(gè)堿基。調(diào)查發(fā)現(xiàn)在許多家蠶品種絲膠1基因啟動(dòng)子中存在序列的插入(缺失)現(xiàn)象，將449bp插入序列與家蠶全基因組序列和Ge

3、nBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列做BLASTN比對(duì)分析表明，它可能是短散在重復(fù)元件(SINE)。對(duì)這一短散在元件的起源、插入位點(diǎn)、功能、功能的作用機(jī)理等方面進(jìn)行了研究。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴根據(jù)日本學(xué)者M(jìn)atsunami在GenBank中提交的絲膠1基因上游調(diào)控序列(AB007831.1)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增家蠶絲膠1基因啟動(dòng)子，選取家蠶、野桑蠶共78個(gè)品系對(duì)絲膠1基因啟動(dòng)子作了調(diào)查。擴(kuò)增結(jié)果表明絲膠1啟動(dòng)子片段大小之間存在差異：7個(gè)

4、品種的基因組DNA擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶(1kb)；46個(gè)品種擴(kuò)增結(jié)果比預(yù)期條帶小，為660bp；9個(gè)品種同時(shí)擴(kuò)增出1kb和660bp大小的兩條帶。利用CLUSTAL．X1.83對(duì)克隆的各個(gè)品種的絲膠1基因啟動(dòng)子序列分析表明：①不同品種絲膠1基因啟動(dòng)子660bp的片段序列相似性都較高，存在兩處由GCTA和Poly(A)引起的插入突變；(2)克隆不同品種的絲膠1基因啟動(dòng)子1kb片段序列的相似性也很高，也同樣存在一處Poly(A)的插入

5、突變；(3)將1kb和660bp序列兩者之間比對(duì)后表明，前者的絲膠1基因啟動(dòng)子中插入了449bp的堿基序列；④兩種類(lèi)型絲膠1基因啟動(dòng)子序列的共同的特點(diǎn)是都存在SA、SB和SC的順式作用元件；⑤擴(kuò)增出的絲膠1基因啟動(dòng)子長(zhǎng)度與家蠶品種的生態(tài)類(lèi)型、地理系統(tǒng)來(lái)源和化性之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性和某種規(guī)律性，在家蠶和野桑蠶之間也未見(jiàn)規(guī)律性。
　　 ⑵利用家蠶全基因組數(shù)據(jù)對(duì)絲膠1基因啟動(dòng)子中449bp的插入序列分析表明，它在家蠶基因組中的拷貝數(shù)為47

6、70個(gè)，且均勻的分布在家蠶染色體上，它在家蠶基因組中整合位點(diǎn)為富含TA區(qū)域，與家蠶反轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明它可能起源于BILINE。根據(jù)它在基因組中的分布、插入位點(diǎn)、起源，推測(cè)它可能是短散在重復(fù)序列(SINE)，并命名為BmSer_SINE。利用PCR和southern雜交技術(shù)確認(rèn)它存在于所有品種的家蠶基因組中。
　　 ⑶將缺失或者刪除的絲膠1基因啟動(dòng)子片段和BmSer_SINE片段克隆到pGL3_basic載體，重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)

7、染草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞(Sf9)和家蠶胚胎細(xì)胞(BmE)。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)間接檢測(cè)缺失或者刪除的絲膠1基因啟動(dòng)子和BmSer_SINE序列活性。結(jié)果表明BmSer_SINE作為啟動(dòng)子的螢火蟲(chóng)熒光素酶在(Sf9)和(BmE)中都有相對(duì)活性，而缺失或者刪除的絲膠1基因啟動(dòng)子片段，僅在含完整BmSer SINE序列時(shí)，在BmE中有微弱的啟動(dòng)活性，而無(wú)論何種序列在Sf9細(xì)胞中均無(wú)啟動(dòng)子活性。結(jié)果表明，完整的BmSer_SINE序列可能具有啟

8、動(dòng)子活性。
　　 ⑷將缺失或者刪除的絲膠1基因啟動(dòng)子和紅色熒光(DsRed)、腺病毒SV40的終止序列構(gòu)建成表達(dá)盒，再將表達(dá)盒克隆到pBac[3XP3—EGFP]載體形成pBac[3XP3—EGFP，Ser—DsRed]重組質(zhì)粒。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別將各種絲膠1基因啟動(dòng)子序列片段驅(qū)動(dòng)的DsRed表達(dá)盒整合到家蠶基因組中形成家蠶轉(zhuǎn)基因系。利用定量PCR檢測(cè)DsRed的轉(zhuǎn)錄水平，檢測(cè)缺失或者刪除的絲膠1基因啟動(dòng)子活性，結(jié)果表明，絲膠1

9、基因啟動(dòng)子中的BmSer_SINE序列具有增強(qiáng)子的活性，利用Western blot檢測(cè)絲膠中DsRed的表達(dá)量，結(jié)果表明BmSer SINE具有增強(qiáng)蛋白質(zhì)翻譯的功能。此外，將轉(zhuǎn)基因系的整個(gè)絲腺、脂肪體在熒光顯微鏡下檢測(cè)，DsRed僅在中部絲腺表達(dá)。結(jié)果表明：①BmSer_SINE對(duì)絲膠1基因啟動(dòng)子的組織特異性表達(dá)沒(méi)有調(diào)控作用；②決定絲膠1蛋白組織特異性表達(dá)的調(diào)控元件在絲膠1基因啟動(dòng)子的—148～—1區(qū)域。
　　 ⑸經(jīng)http：

10、//www．cbil．upenn．edu/cgi—bin/tess/tess?RQ=WELCOME預(yù)測(cè)BmSer_SINE序列中含有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，凝膠遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BmSer_SINE中存在的順式元件能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，Cy3標(biāo)記的片段與轉(zhuǎn)錄因子形成的復(fù)合物經(jīng)LC/MS/MS鑒定為真核生物翻譯起始因子、延伸因子、ATPase、GTP結(jié)合蛋白及核糖核蛋白等核因子。
　　 ⑹將BmSer_SINE與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)和家蠶EST