miRNA-302d抑制DACH1表達(dá)促進(jìn)肺腺癌和肺鱗癌增殖的機(jī)制研究.pdf

1、DAHC1基因位于13號(hào)染色體長臂的21帶上，該基因作為新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其表達(dá)的蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌以及前列腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移的作用。臨床研究結(jié)果提示，DACH1在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌以及前列腺癌中表達(dá)缺失或低表達(dá)。臨床統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌以及子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織中DACH1表達(dá)水平與患者原發(fā)腫瘤大小、原發(fā)灶分期、腹膜轉(zhuǎn)移以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)DACH1表達(dá)水平與乳腺癌腫瘤組織

2、中細(xì)胞增殖狀況呈相反關(guān)系。盡管DACH1在腫瘤中的重要作用已有許多報(bào)道報(bào)道，但目前有關(guān)該基因在肺癌的作用尚未有研究報(bào)道。我們在前期研究中，通過基因芯片對(duì)5例肺腺癌和5例肺鱗癌組織與其對(duì)應(yīng)癌旁組織的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)肺癌組織中DACH1的mRNA表達(dá)水平較癌旁組織明顯下調(diào)，提示DACH1表達(dá)下調(diào)與肺癌發(fā)生發(fā)展可能存在相關(guān)性。因此，本研究擬通過擴(kuò)大樣本量，利用熒光定量PCR以及Western-blotting方法檢測DACH1表達(dá)水平

3、，以進(jìn)一步明確DACH1在肺腺癌和肺鱗癌組織表達(dá)是否存下調(diào)。在此基礎(chǔ)上，我們將按照用生物信息學(xué)分析結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法分析DACH1在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)的原因。明確了DACH1表達(dá)下調(diào)的原因以后，我們將嘗試探索DACH1表達(dá)下調(diào)對(duì)肺腺癌和肺鱗癌發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響的內(nèi)在分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 第一部分、DACH1在肺腺癌和肺鱗癌及對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)
　　 目的:檢測DACH1在肺腺癌和肺鱗癌及其對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)，以明確D

4、ACH1在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。
　　 方法:(1)1.抽提59例肺腺癌和46例鱗癌及其對(duì)應(yīng)正常組織的總RNA;2.將RNA反轉(zhuǎn)錄成不易分解的cDNA;3.采用RT-PCR方法對(duì)DACH1的mRNA水平表達(dá)進(jìn)行檢測。(2)1.利用蛋白裂解液等溶劑抽提59例肺腺癌和46例腺癌組織及其對(duì)應(yīng)正常組織中的蛋白;2.采用Bradford方法，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以測定組織蛋白濃度;3.配制SDS-PAGE電泳液，并按實(shí)驗(yàn)相應(yīng)條件進(jìn)行S

5、DS-PAGE電泳;4.利用PVDF膜，按轉(zhuǎn)膜條件進(jìn)行轉(zhuǎn)膜;5.在不同條件下，分別加入一抗、二抗進(jìn)行免疫反應(yīng);6.進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件;7.凝膠圖像分析。
　　 結(jié)果:(1).腫瘤組織中DACH1的mRNA表達(dá)水平低于對(duì)應(yīng)癌旁（正常）組織內(nèi)DACH1的mRNA表達(dá)水平;(2).腫瘤組織內(nèi)DACH1蛋白含量均低于對(duì)應(yīng)癌旁（正常）組織內(nèi)DACH1蛋白含量，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，肺癌標(biāo)本內(nèi)DACH1蛋白表達(dá)水平與患

6、者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)侵襲無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與患者臨床分期顯著相關(guān)(P=0.008＜0.01)。
　　 結(jié)論:DACH1在肺腺癌和肺鱗癌組織中低表達(dá)，提示DACH1表達(dá)異常與肺腺癌和肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。
　　 第二部分、DACH1表達(dá)下調(diào)的機(jī)制研究
　　 目的:探討調(diào)控DACH1 mRNA及蛋白表達(dá)下調(diào)的機(jī)制。
　　 方法:(1)DNA甲基化對(duì)DACH1轉(zhuǎn)錄的影響:通過生物信息學(xué)分析尋找

7、DACH1啟動(dòng)子和第一內(nèi)含子序列中的CpG島，采用亞硫酸鹽測序法分析肺腺癌和肺鱗癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁組織中DACH1基因的CpG島的甲基化狀態(tài);(2)miRNA對(duì)DACH1翻譯的影響:通過生物信息學(xué)分析結(jié)合miRNA芯片篩選調(diào)控DACH1表達(dá)的潛在miRNA，合成相應(yīng)miRNA雙鏈模擬物或阻遏物轉(zhuǎn)染肺腺癌和鱗癌細(xì)胞株，利用RT-PCR以及Western-blotting檢測miRNA過表達(dá)或低表達(dá)對(duì)DACH1表達(dá)水平的影響;(3)miRNA

8、對(duì)DACH1表達(dá)的直接調(diào)控作用:構(gòu)建DACH1基因3'UTR區(qū)熒光素酶報(bào)告基因載體，通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miRNA對(duì)DACH1的直接調(diào)控作用。
　　 結(jié)果:(1).DACH1第一內(nèi)含子富含CpG島，但肺腺癌組織和肺鱗癌組織與其對(duì)應(yīng)癌旁組織并不存在甲基化差異;(2)生物信息學(xué)結(jié)合芯片篩選提示miRNA-302d、miRNA-429、miRNA-7是以DACH1為靶基因且在肺腺癌和肺鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)的miRNA，但miRN

9、A-302d、miRNA-429、miR-NA7過表達(dá)和低表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞中DACH1的mRNA表達(dá)水平均無顯著影響(P=0.67＞0.05，P=0.78＞0.05)，而miRNA-302d過表達(dá)和低表達(dá)均顯著影響肺腺癌和肺鱗癌細(xì)胞中DACH1蛋白的表達(dá)水平(P=0.007＜0.01，P=0.009＜0.01);(3)miRNA-302d可直接結(jié)合于DACH1基因3'UTR區(qū)對(duì)DACH1蛋白的具有直接調(diào)控的作用。
　　 結(jié)論:(1

10、).DACH1基因在肺癌組織與癌旁組織中并不存在甲基化差異，提示基因甲基化并不是DACH1在肺癌組織內(nèi)表達(dá)下調(diào)的原因;(2).miRNA-302d過表達(dá)或低表達(dá)均可調(diào)控肺癌細(xì)胞中DACH1蛋白的表達(dá)但對(duì)DACH1的mRNA表達(dá)無顯著影響，提示miRNA-302d過表達(dá)是抑制肺癌組織中DACH1表達(dá)的原因之一;(3).miRNA-302d結(jié)合于DACH1基因3'UTR區(qū)對(duì)DACH1蛋白的具有直接調(diào)控的作用。
　　 第三部分、miR

11、NA-302d在肺腺癌和肺鱗癌以及對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)
　　 目的:檢驗(yàn)臨床組織標(biāo)本中59例肺腺癌和46例肺鱗癌及其對(duì)應(yīng)正常組織中miRNA-302d水平，以驗(yàn)證miRNA-302d在肺腺癌和肺鱗癌與其對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)是否存在差異。
　　 方法:(1)1.利用組織研磨機(jī)在液氮條件下充分磨碎組織;2.利用RNA抽提試劑盒，嚴(yán)格按照操作手冊要求和方法抽提組織中RNA;3.根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求配制RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，利用PCR儀進(jìn)

12、行反轉(zhuǎn)錄獲得c-DNA，稀釋后4℃保存;4.根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求配制RT-PCR反應(yīng)液，利用RT-PCR儀進(jìn)行miRNA302-d擴(kuò)增實(shí)驗(yàn);5.利用steponesoftware軟件分析miRN-302d擴(kuò)增結(jié)果，收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(2).利用t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析miRNA-302d表達(dá)異常與肺癌患者臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:(1).miRN-302d在肺癌腺癌鱗癌內(nèi)高表達(dá)。(2).miRN-302d表達(dá)與患者年齡、性別

13、、腫瘤大小、淋巴結(jié)侵襲無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與患者臨床分期顯著相關(guān)(P=0.006＜0.01)。
　　 結(jié)論:miRNA-302d在肺腺癌和肺鱗癌組織中表達(dá)水平顯著上升且與臨床分期相關(guān)，提示miRNA-302d可能與肺腺癌和肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 第四部分、miRNA-302d抑制DACH1表達(dá)促進(jìn)肺腺癌和肺鱗癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究
　　 目的:1.明確miRNA-302d對(duì)肺腺癌和肺鱗癌細(xì)胞增殖的影響;2

14、.探討miRNA-302d通過抑制DACH1蛋白表達(dá)促進(jìn)肺腺癌和肺鱗癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。
　　 方法:1.合成相應(yīng)miRNA雙鏈模擬物或阻遏物轉(zhuǎn)染肺腺癌和鱗癌細(xì)胞株，以觀察miRNA-302d過表達(dá)或低表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖能力的影響;2.利用流式細(xì)胞儀檢測miRNA-302d過表達(dá)或低表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞周期的影響;3.采用MTT實(shí)驗(yàn)方法觀察miRNA-302d過表達(dá)或低表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖活性的影響;4.采用細(xì)胞平板成克隆實(shí)驗(yàn)方法，觀

15、察miRNA-302d過表達(dá)或低表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞成克隆能力的影響;5.通過miRNA雙鏈模擬物與特異針對(duì)DACH1的siRNA共轉(zhuǎn)細(xì)胞，驗(yàn)證miRNA-302d是否通過調(diào)控DACH1的表達(dá)影響肺腺癌和肺鱗癌的增殖。
　　 結(jié)果:1.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖活性檢測實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞平板成克隆能力實(shí)驗(yàn)均的結(jié)果提示miRNA-302d可調(diào)控肺腺癌和肺鱗癌細(xì)胞的增殖;2.miRNA雙鏈模擬物與特異針對(duì)DACH1的siRNA共轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果則提示mi