GILZ基因沉默增強(qiáng)膿毒癥血清誘導(dǎo)成肌細(xì)胞合成代謝的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:構(gòu)建靶向大鼠GILZ的siRNA腺病毒載體，研究GILZ基因沉默對(duì)膿毒癥血清誘導(dǎo)成肌細(xì)胞代謝的影響。
　　方法:
　　(1)應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔法建立大鼠膿毒癥模型，留取膿毒癥血清。
　　(2)設(shè)計(jì)靶向大鼠GILZ mRNA的特異性siRNA，退火形成雙鏈DNA Oligo，插入AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切的GV119載體，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證后與骨架質(zhì)粒pBHG loxΔE1,3 Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，收集

2、重組腺病毒，擴(kuò)增純化后測(cè)定病毒滴度。
　　(3)重組腺病毒感染體外培養(yǎng)的L6細(xì)胞，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況及形態(tài)學(xué)改變，測(cè)定重組腺病毒的感染效率，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)GILZ的表達(dá)量。
　　(4)膿毒癥血清誘導(dǎo)72h后，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)GILZ、MyHC、MyoD、myogenin的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　(1)應(yīng)用盲腸結(jié)扎穿孔法可成功建立膿毒癥大鼠模型，大鼠的一般情況、體重、肛溫、炎癥

3、指標(biāo)、細(xì)菌培養(yǎng)及開(kāi)腹探查結(jié)果符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　(2)成功構(gòu)建重組腺病毒，測(cè)序結(jié)果顯示siRNA正確插入GV119，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果顯示Ad-siRNA-1-GILZ組的GILZ表達(dá)量最低，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其沉默效率為59.8％，重組腺病毒滴度為2.0×1010PFU/mL。
　　(3)Ad-siRNA-1-GILZ在Enhanced Infection Solution的