通過重編程方法將大鼠肝細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞的研究.pdf

1、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)是利用特異的誘導(dǎo)因子組合，如重編程因子組合或結(jié)合某些小分子化合物等將成熟的體細(xì)胞去分化為類似于胚胎干細(xì)胞的一種多潛能細(xì)胞。這些細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞的特征，并能分化為三種胚層細(xì)胞。有關(guān)iPSCs的研究極大地促進(jìn)了細(xì)胞的分化調(diào)控、再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞發(fā)育等基礎(chǔ)研究，并有極高的臨床應(yīng)用前景。
　　本文利用慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將重編程因子組合Sox2、Oct4、c-Myc和Klf4導(dǎo)入原代培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞，對其進(jìn)

2、行誘導(dǎo)去分化。肝細(xì)胞在含四種重編程因子的重組慢病毒感染7天后，其形態(tài)開始發(fā)生改變。將其轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)層細(xì)胞(MEFs)上培養(yǎng)11天后，部分細(xì)胞聚集在一起，呈致密克隆狀生長，邊界清晰且致密整齊，形成與大鼠胚胎干細(xì)胞相似的克隆。這些克隆細(xì)胞較小、增殖迅速，且在高倍鏡下觀察到細(xì)胞核較大，核質(zhì)比率較高。從克隆形態(tài)初步判斷為大鼠iPSCs克隆，堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示，這些細(xì)胞克隆表達(dá)了高水平的堿性磷酸酶。
　　采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分

3、別分析誘導(dǎo)的細(xì)胞克隆、大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞和大鼠4.5天胚胎中的基因表達(dá)狀況。結(jié)果顯示外源重編程因子(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)僅在誘導(dǎo)的細(xì)胞克隆中表達(dá)；大鼠胚胎干細(xì)胞標(biāo)志基因Sox2、Oct4、Nanog、Fgf4、Lin28和Ncam在誘導(dǎo)的細(xì)胞克隆和4.5天大鼠胚胎中均有表達(dá)。進(jìn)一步的免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示，上述誘導(dǎo)的細(xì)胞克隆表達(dá)了大鼠胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白SSEA-1和Nanog。綜上結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)成功地將大鼠原