銀耳生長過程酶系分泌規(guī)律及木聚糖酶純化與性質(zhì)分析.pdf

1、銀耳（Tremella fuciformis）自身沒有分解木質(zhì)纖維素與淀粉基質(zhì)的能力，需要與香灰菌（Hypoxylon sp）進行共生培養(yǎng)，香灰菌可以分泌相關(guān)基質(zhì)降解酶對栽培料的基質(zhì)進行分解，為銀耳生長發(fā)育提供營養(yǎng)。本實驗對純香灰菌培養(yǎng)及其與銀耳混合培養(yǎng)過程中的纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、漆酶等關(guān)鍵酶的變化規(guī)律進行比較與分析，實驗結(jié)果及前人資料均表明銀耳在栽培過程中會產(chǎn)生高活性的木聚糖酶，本實驗采用硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素過

2、柱、葡聚糖凝膠過柱等多個方法對銀耳菌糠中的木聚糖酶進行分離純化并探究其理化性質(zhì),最后將其應(yīng)用于對麩皮、棉籽殼、甘蔗渣、紙箱及報紙等木聚糖提取液的處理。這些研究結(jié)果對銀耳優(yōu)良菌種的制作、高產(chǎn)栽培及廢菌包的綜合利用提供了重要依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、銀耳與香灰菌混合培養(yǎng)過程中酶系的變化規(guī)律
　　將銀耳與香灰菌接種到同一個菌包中混合培養(yǎng)，對照組只接種純香灰菌。等菌絲長滿袋后，每隔5d取樣測定纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白

3、酶、漆酶等培養(yǎng)原料基質(zhì)降解相關(guān)酶的活性。實驗結(jié)果表明：純香灰菌菌絲長滿袋后，纖維素酶活力5 d后穩(wěn)定在40 U·mL-1左右；淀粉酶活力在25 d時降低至500 U·mL-1左右；木聚糖酶活力在15 d時達到最大值35.3 U·mL-1，之后基本穩(wěn)定不變；蛋白酶活力在25 d時，降低至1 U·mL-1左右；漆酶活力在5 d-15 d之間，升高至25 U?mL-1，但之后迅速降低，到25 d時，已經(jīng)檢測不到漆酶活性。
　　香灰菌與銀

4、耳混合培養(yǎng)菌絲長滿袋后，纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶及漆酶活力均明顯提高。纖維素酶活力從菌絲長滿袋第5 d開始升高，20 d時達到210 U·mL-1，相對于純香灰菌培養(yǎng)時酶活力提高了5倍；淀粉酶活力在10 d后，穩(wěn)定在2253 U·mL-1左右；木聚糖酶活力在25 d時，達到57.2 U·mL-1；漆酶活力在第5 d時，達到最大值71.33 U·mL-1，之后迅速下降，15 d后檢測不到漆酶活性。說明銀耳與香灰菌菌絲混合培養(yǎng)過程中，兩者

5、之間存在明顯的互作效應(yīng)。
　　2、銀耳菌糠中木聚糖酶的分離純化
　　以銀耳菌糠為原料提取粗酶液，采用硫酸銨沉淀法處理粗酶液，結(jié)果表明該木聚糖酶的硫酸銨沉淀最佳初始濃度為50％，最佳終濃度為80%，經(jīng)過硫酸銨沉淀后，木聚糖酶比活達到355.35 U·mg-1，純化倍數(shù)達1.4088倍，回收率為85.12%；利用層析柱對粗酶液進行 DEAE-纖維素過柱分離，純化效果良好，木聚糖酶比活達到5439.367 U·mg-1，純化倍數(shù)高

6、達15.6倍，回收率為90%；通過葡聚糖凝膠層析過柱后，木聚糖酶比活為8091.866 U·mg-1，純化倍數(shù)達1.49倍，回收率為83.1%；SDS-PAGE蛋白電泳圖顯示經(jīng)過純化后的木聚糖酶僅有一條條帶，大小在30 Kda-35 Kda之間，表明純度較高，純化效果較好。
　　3、純化后的木聚糖酶理化性質(zhì)分析及其應(yīng)用
　　相對活性曲線表明，該木聚糖酶的最適pH為6.0，pH處于3-10范圍內(nèi)相對酶活均能達到80%以上，表現(xiàn)

7、出比較穩(wěn)定的高活性；最適溫度為50℃，在20-40℃之間比較穩(wěn)定，處理1 h，酶活性始終保持在90%以上；在低濃度（1 mM）情況下，Mg2+、Ca2+、Ba2+對該木聚糖酶活性有一定的促進作用，F(xiàn)e2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、SDS、EDTA則對其有明顯的抑制作用，其中Fe3+與SDS抑制效果最強，會導(dǎo)致其喪失大部分活性；在高濃度（10 mM）情況下，Ba2+、Ca2+、Mg2+、Zn2、Fe2+、Mn2+、Cu2+

8、、Fe3+等金屬離子及巰基乙醇、SDS、EDTA等試劑對該酶活性均有一定的抑制作用，其中Fe2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+及SDS對其抑制效果較明顯，會導(dǎo)致其喪失大部分活性。當(dāng)試劑濃度繼續(xù)升高時（50 mM），吐溫80對其有明顯促進作用，巰基乙醇、SDS、EDTA對其均有明顯抑制作用，仍然是SDS的抑制效果最強，使該酶相對活性降低近90%。
　　控制其他條件相同，只改變底物濃度（樺木木聚糖濃度從1-10 mg/mL），測定酶促

9、反應(yīng)動力學(xué)的反應(yīng)初始速度V，利用Michaelis-menten方程求得該木聚糖酶Km=2.3 mg·mL-1，V max=384.6 ug·(mL·min)-1。
　　用麩皮、甘蔗渣、廢紙箱、報紙及棉籽殼等廢料制備木聚糖提取液，往各提取液中加入純化后的木聚糖酶，測定最終木糖濃度，得出各提取液中木聚糖的含量，接著探究該木聚糖酶與這些提取液反應(yīng)時酶活力大小及最佳水浴時間，最后將粗酶液分別加入到各廢料提取液中，在50℃，pH6.0條件