豬印記基因MAGEL2組織表達(dá)分析和啟動(dòng)子的克隆與活性分析.pdf

1、MAGEL2基因在人、鼠和豬中都是父源表達(dá)，為母系印記基因，在下丘腦發(fā)揮重要的調(diào)控功能。鼠中該基因異常表達(dá)，不僅出現(xiàn)母鼠的后代照看、生物鐘調(diào)節(jié)和繁殖能力下降，而且公鼠的性行為出現(xiàn)嗅覺功能障礙，幼崽斷奶前死亡率上升。這些研究表明MAGLE2基因和哺乳動(dòng)物的繁殖性狀有著重要的關(guān)系。本研究為了研究MAGEL2基因在豬中的表達(dá)與豬的母性行為的相關(guān)性，以母性差異極大的梅山豬與杜洛克豬作為研究對(duì)象，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)下丘腦等13個(gè)組織的表

2、達(dá)情況做了分析，并對(duì)不同時(shí)期的胎盤表達(dá)做了分析;為進(jìn)一步研究MAGEL2基因表達(dá)的分子機(jī)制，本研究克隆了MAGEL2基因的啟動(dòng)子，對(duì)其進(jìn)行了信息學(xué)分析，并構(gòu)建了啟動(dòng)子缺失片段熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，利用細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行了啟動(dòng)子活性分析。
　　 本研究主要取得了如下結(jié)果和結(jié)論:
　　 1.本研究為分析MAGEL2基因在不同豬種以及不同組織間的表達(dá)差異，從而探討MAGEL2基因和豬繁殖性狀之間的關(guān)系，采用熒光定

3、量PCR技術(shù)檢測(cè)MAGEL2基因組織表達(dá)水平。MAGEL2基因在所有被檢測(cè)初生豬組織中都有表達(dá)，在下丘腦中的表達(dá)量最高(P＜0.01)，而且梅山豬下丘腦中的表達(dá)量極顯著高于杜洛克豬(P＜0.01)。雖然MAGEL2基因在梅山豬懷孕不同時(shí)期胎盤表達(dá)量沒有顯著性差異(P＞0.05)，但是梅山豬懷孕30天胎盤中表達(dá)量極顯著高于杜洛克豬(P＜0.01)，而且在分娩后脫落的胎盤中不表達(dá)。所以MAGEL2基因與豬母性行為和胎盤功能可能密切相關(guān)，是與

4、豬繁殖性狀相關(guān)的候選基因。
　　 2.通過5'RACE技術(shù)，克隆得到了MAGEL2基因110bp的5'UTR序列，確定了該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。根據(jù)豬基因組序列，克隆了梅山豬和杜洛克豬起始密碼子前約2kb的序列，對(duì)梅山豬啟動(dòng)子1883bp和杜洛克豬啟動(dòng)子1885bp，包含110bp的5'UTR序列，進(jìn)行了信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，兩種豬的序列存在9處堿基差異，其中梅山豬缺失了2個(gè)堿基，這些堿基的差異可能是造成該基因在不同豬種間差異表達(dá)

5、的原因之一。在這近2kb的范圍內(nèi)并不存在CpG島，但預(yù)測(cè)得到兩個(gè)得分較高的核心啟動(dòng)子序列，為別為TTTTCCCCCTATATATTAACCTTGGATCTATTCATTCCTCATTTTATTAT(Atart:-1164,End:-1115,Score:0.87)和ATACCCCATTCTAAAAATGTTGCCACTTGTGGGTGTCTGGAACATCTCAA(Atart:-1002，End:-953，Score:0.97)，在18

6、85啟動(dòng)子序列中TATA盒共有18個(gè)，而具有典型TATA盒序列特征的共有7個(gè)，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前1000bp以內(nèi)，而且靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)100bp范圍內(nèi)有兩個(gè)GC盒(GGGCGG)，通過TESS網(wǎng)站預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括很多常見的轉(zhuǎn)錄因子如Sp1、GR、YY1、C/EBPβ、TFIID的結(jié)合位點(diǎn)。這些特點(diǎn)預(yù)示著MAGEL2基因啟動(dòng)子可能是個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，所以我們對(duì)其啟動(dòng)子活性進(jìn)行了試驗(yàn)研究。
　　 3.通過亞克隆，載體構(gòu)

7、建等技術(shù)成功構(gòu)建了MAGEL2基因啟動(dòng)子缺失片段熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-110、pGL3-261、pGL3-466和pGL3-1281。并利用細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，將上述載體轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞，通過熒光素酶活性檢測(cè)分析了各啟動(dòng)子缺失片段的活性，結(jié)果表明，pGL3-110載體熒光素酶活性較低，和陰性對(duì)照沒有顯著性差異(P＞0.05);pGL3-261載體相對(duì)熒光素酶活性最高，pGL3-466和pGL3-1281載體的相對(duì)活性