2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩101頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、過敏性哮喘是以氣道高反應(yīng)性(airwayhypersensitivity,AHR)、嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞過度浸潤以及血清高水平IgE為特征的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病。目前研究認(rèn)為,T淋巴細(xì)胞優(yōu)勢性分泌IL-4、IL-5、IL-13等Th2類細(xì)胞因子在過敏性哮喘的引發(fā)中扮演著重要角色。
   Cd3001f(CD300antigenlikefamilymemberF)分子是一個氨基端帶有信號肽、胞外段帶有IgV樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)

2、、胞內(nèi)段帶有免疫受體酪氨酸抑制基序(immune-receptortyrosine-basedinhibitorymotifs,ITIM)和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)化基序(immune-receptortyrosine-basedswitchingmotif,ITSM)的I型糖蛋白,有研究顯示,阻斷或沉默樹突狀細(xì)胞表面Cd3001f分子的表達(dá)能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞啟動的T細(xì)胞增殖以及抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答,表明Cd3001f分子具有負(fù)向調(diào)控樹突狀細(xì)胞

3、啟動T細(xì)胞應(yīng)答的功能。
   在本研究中,我們根據(jù)GenBank提供的小鼠Cd3001f基因核酸序列(NM145634.3),設(shè)計含完整開放閱讀框(openreadingframe,ORF)的Cd3001f基因特異性引物,采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)從小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞(bonemarrow-deriveddendritic

4、cells,BMDCs)中擴(kuò)增得到Cd3001f基因,將其與pMD-18T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-Cd3001f。經(jīng)生物信息學(xué)分后,設(shè)計特異性引物以重組質(zhì)粒pMD-Cd3001f為模板聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)擴(kuò)增Cd3001f基因編碼區(qū)不合信號肽的胞外段,將其與pGEX-4T-3載體連接構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Cd3001f(22aa-185aa)。原核表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ros

5、etta(E3)后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了約45.5kD的GST-Cd3001f(22aa-185aa)融合蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)GSTrapFF親和層析柱純化后皮下免疫接種新西蘭大白兔,制備了抗GST-Cd3001f(22aa-185aa)融合蛋白多克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)結(jié)果顯示,其抗體效價高達(dá)1:16384。將Cd3001f基因真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞(h

6、umanembryonickidney293cells,HEK293),間接免疫熒光實驗(indirectimmunofluorescenceassays,IIFA)和免疫印跡實驗(Westernblot)檢測兔抗GST-Cd3001f(22-185aa)融合蛋白多克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示,該多克隆抗體能夠特異性的識別Cd3001f真核表達(dá)蛋白。
   根據(jù)siRNA設(shè)計原則,設(shè)計5對小鼠Cd3001f基因保守序列編碼短發(fā)卡R

7、NA(shorthairpinRNA,shRNA)的正義、反義寡核苷酸鏈,將其退火后分別克隆至pLL3.7質(zhì)粒載體中獲得Cd3001f基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體法,分別將Cd3001f基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒與Cd3001f基因真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA-Cd3001f共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時。Real-timePCR分析顯示,重組質(zhì)粒pLL-Cd3001f-shRNAe對Cd3001f基因mRNA抑制率為75.6%。以重組質(zhì)粒

8、pMD18-Cd3001f為模板PCR擴(kuò)增Cd3001f基因,將其插入穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中。以重組質(zhì)粒pLL-Cd3001f-shRNAe為模板PCR擴(kuò)增含U6啟動子的Cd3001f基因shRNA,將其插入穿梭質(zhì)粒pAdTrack中。PmeⅠ酶切陽性重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化含重組腺病毒骨架質(zhì)粒Adeasy-1的感受態(tài)菌BJ5183,進(jìn)行同源重組。PacⅠ酶切重組腺病毒載體后,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后12-18天,獲得重組

9、腺病毒Ad-Cd3001f、Ad-Cd3001f-shRNA。大量擴(kuò)增重組腺病毒,并采用CsCl密度梯度離心法進(jìn)行純化。重組腺病毒Ad-Cd3001f滴度為1.4×109PFU/ml,Ad-Cd3001f-shRNA滴度為2.6×109PFU/ml。以感染復(fù)數(shù)(amultiplicityofinfection,MOI)為75的重組腺病毒感染BMDCs48小時。Real-timePCR分析顯示,Ad-Cd3001f感染細(xì)胞中Cd3001f

10、基因mRNA的表達(dá)水平顯著升高,而Ad-Cd3001f-shRNA感染細(xì)胞中Cd3001f基因mRNA表達(dá)水平下降達(dá)51.7%。Westernblot分析顯示,Ad-Cd3001f感染細(xì)胞特異性地表達(dá)了Cd3001f蛋白。
   分別于第0天、第14天給C57BL/6小鼠腹腔注射經(jīng)凝膠佐劑乳化的卵清白蛋白(ovalbumin,OVA),第二次致敏后10天OVA溶液連續(xù)激發(fā)3天。以MOI為75的重組腺病毒Ad-Cd3001f(DC

11、-Cd3001f)和Ad-Cd3001f-shRNA(DC-siCd3001f)分別感染培養(yǎng)5天的BMDCs24小時,再用OVA激發(fā)24小時。分別于OVA首次致敏前7天和致敏后3天小鼠腹腔注射DC-Cd3001f或DC-siCd3001f。最后一次激發(fā)后24小時,檢測氣道高反應(yīng)性。吉姆薩瑞氏染色行肺泡灌洗液炎性細(xì)胞分類計數(shù)。H&E和PAS染色觀察肺組織病理學(xué)變化。ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavage

12、fluid,BALF)、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的含量。流式細(xì)胞術(shù)檢測脾細(xì)胞中CD4+Foxp3+Tregs和CD4+IL-17A+Th17的百分比。研究結(jié)果顯示,DC-siCd3001f免疫哮喘小鼠后能夠減輕氣道高反應(yīng)性和肺組織炎癥,降低肺泡灌洗液和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5和IL-13的分泌,提高脾細(xì)胞中CD4+Foxp3+Tregs的百分比,降低脾細(xì)胞中CD4+IL-17A+Th17的百分

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論