噬菌體對小鼠泛耐藥鮑曼不動桿菌膿毒癥療效的研究.pdf

1、目前鮑曼不動桿菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要致病菌之一，而且在燒傷病房尤其突出，筆者所在科室燒傷重癥病房2011年1月至2014年12月收治的162例燒傷患者的血液標(biāo)本共計1658份，病原菌檢出339株，前三位分別是鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii ABA)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SAU)以及銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PAE)。國內(nèi)大部分文獻(xiàn)報

2、道鮑曼不動桿菌的檢出率僅低于銅綠假單胞菌，位居第二。據(jù)國外文獻(xiàn)報道，1991年紐約首次暴發(fā)鮑曼不動桿菌感染以來，世界各地對鮑曼不動桿菌耐藥現(xiàn)象的報道層出不窮，尤其是對碳青霉烯類抗菌素耐藥現(xiàn)象的增多，使成功治療鮑曼不動桿菌所致感染變得困難。加上開發(fā)新的抗菌素周期長，耗費資金巨大以及細(xì)菌耐藥變異迅速，亟需尋找新的治療方案。噬菌體是一種以細(xì)菌為宿主的病毒，噬菌體制劑經(jīng)過臨床驗證能夠有效治療細(xì)菌感染。1958年，我國細(xì)菌學(xué)教授余賀，就利用噬菌體

3、成功治療了銅綠假單胞菌所致燒傷患者感染。過去幾十年里，大量抗生素得以研發(fā)并廣泛應(yīng)用于臨床，相應(yīng)限制了噬菌體的使用。近年來，隨著細(xì)菌耐藥情況越來越嚴(yán)重，歐美國家開始重新重視噬菌體在細(xì)菌感染治療中的作用，國內(nèi)一些單位也開始進(jìn)行相關(guān)研究。筆者單位在篩選分離噬菌體并建立噬菌體庫方面進(jìn)行探索。
　　目的：
　　本研究通過篩選泛耐藥鮑曼不動桿菌裂解性噬菌體，建立泛耐藥鮑曼不動桿菌所致小鼠膿毒癥模型，并使用所篩選到的噬菌體進(jìn)行相關(guān)的動物實

4、驗。通過分析噬菌體治療后小鼠存活情況、對白細(xì)胞計數(shù)的影響及其細(xì)菌清除情況，觀察和研究噬菌體對來源于燒傷患者的泛耐藥鮑曼不動桿菌所致小鼠膿毒癥的治療效果。
　　方法：
　　(1)泛耐藥鮑曼不動桿菌裂解性噬菌體的分離與保存
　　使用混合宿主菌擴(kuò)增噬菌體的方法，以泛耐藥鮑曼不動桿菌為宿主菌，在筆者所在醫(yī)院未經(jīng)處理的污水池中取污水篩選得到泛耐藥鮑曼不動桿菌裂解性噬菌體8株，并測定各株裂解性噬菌體的裂解譜，選取其裂解譜最寬、裂解

5、效果最好的裂解性噬菌體備用，作為抗菌劑進(jìn)行后續(xù)動物治療實驗。
　　(2)小鼠泛耐藥鮑曼不動桿菌膿毒癥模型的建立
　　將48只8～12周齡雄性健康BALB/c小鼠，隨機(jī)分為4組，每組12只，記為A，B，C，D四組。分別向A，B，C，D，四組小鼠腹腔注射泛耐藥鮑曼不動桿菌5×108CFU/mL，2.5×108CFU/mL，1×108CFU/mL，5×107CFU/mL這四個濃度的菌液各1mL。注射成功后，將各組小鼠按正常飼養(yǎng)，密

6、切觀察各組小鼠生命體征，死亡小鼠數(shù)量，腹腔灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，血培養(yǎng)結(jié)果。
　　(3)噬菌體對小鼠泛耐藥鮑曼不動桿菌膿毒癥的治療效果
　?、?將60只BALB/c小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、膿毒癥對照組、抗生素治療組、噬菌體治療組、噬菌體對照組，每組12只?？瞻讓φ战M小鼠腹腔（注射部位下同）注射生理鹽水1mL;膿毒癥對照組、抗生素治療組、噬菌體治療組小鼠注射5×107CFU/mL鮑曼不動桿菌1mL建立膿毒癥模型。2h

7、后，膿毒癥對照組注射生理鹽水1mL，抗生素治療組注射1mg/mL亞胺培南/西司他丁1mL，噬菌體治療組腹腔注射1×108PFU/mL噬菌體1mL;噬菌體對照組注射1×108PFU/mL噬菌體1mL。每組均連續(xù)注射7d，每天觀察記錄小鼠存活情況。
　?、?另取60只BALB/c小鼠，同Ⅰ分組處理。實驗第2、4、6天當(dāng)天注射前，每組選1～3只存活小鼠，每只鼠取眶靜脈血20μL檢查白細(xì)胞計數(shù)。實驗第2天取血小鼠另取1mL眶靜脈血行細(xì)菌培

8、養(yǎng);另取小鼠肺、肝、腎、脾組織，勻漿、稀釋后行菌落計數(shù)后計算細(xì)菌含量。對數(shù)據(jù)行Wilcoxon秩和檢驗、單因素方差分析、LSD檢驗及Kruskal-Wallis秩和檢驗。
　　結(jié)果：
　　(1)以22株泛耐藥鮑曼不動桿菌為宿主菌，筆者所在醫(yī)院未經(jīng)消毒處理的污水池為噬菌體來源，共篩選得到8株裂解性噬菌體，通過噬菌體裂解譜測定，其中Bp201404072號噬菌體裂解譜59％，高于其他7株噬菌體，故選取該株噬菌體作為抗菌劑，用于后

9、續(xù)動物實驗，4℃冰箱凍存。
　　(2)各組小鼠注射不同濃度鮑曼不動桿菌后，四組小鼠均出現(xiàn)典型的膿毒癥相關(guān)癥狀，其中A，B兩組小鼠較C，D兩組急性感染癥狀明顯。實驗第7天，A，B，C，D四組小鼠均死亡。其中A組小鼠實驗第3天均死亡，B組小鼠于實驗第4天全部死亡，C組小鼠于實驗第5天全部死亡，D組小鼠于實驗第7天均死亡（其中一只小鼠存活時予以處死，取眶靜脈血做細(xì)菌培養(yǎng)）。各組小鼠生存天數(shù)采用log-rank test，與D組相比，其他

10、各組存活天數(shù)較短（P=0.002，有統(tǒng)計學(xué)差異）。A，B，C，D四組小鼠腹腔灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)可見明顯菌落形成。D組存活小鼠眶靜脈血培養(yǎng)結(jié)果提示陽性，細(xì)菌學(xué)鑒定結(jié)果提示為鮑曼不動桿菌。對比各組實驗結(jié)果，D組注射菌液濃度(5×107CFU/mL)符合后續(xù)動物實驗要求。故后續(xù)小鼠泛耐藥鮑曼不動桿菌膿毒癥模型菌液濃度定為5×107CFU/mL。
　　(3)Ⅰ.實驗第7天，空白對照組、膿毒癥對照組、抗生素治療組、噬菌體治療組、噬菌體對照組小鼠

11、存活數(shù)分別為12、0、8、10、12只。與膿毒癥對照組比較，其余4組小鼠存活比均明顯升高（Z值為55.635～106.593，P值均小于0.05）;噬菌體治療組小鼠存活率稍高于抗生素治療組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.797，P＞0.05)。
　　Ⅱ.膿毒癥對照組、抗生素治療組、噬菌體治療組小鼠實驗第2天分別死亡3、2、1只，實驗第4天分別死亡10、7、6只，實驗第6天分別死亡12、11、8只。實驗第2天，空白對照組、噬菌體治療組

12、、噬菌體對照組小鼠白細(xì)胞計數(shù)相近，3組均明顯低于膿毒癥對照組的(P＜0.05)，且后2組明顯低于抗生素治療組的（P值均小于0.05）。實驗第4天，抗生素治療組、噬菌體治療組、噬菌體對照組小鼠白細(xì)胞計數(shù)相近，明顯低于空白對照組(P＜0.05)，前4組白細(xì)胞計數(shù)均明顯低于膿毒癥對照組(P＜0.01)。實驗第6天，空白對照組、抗生素治療組、噬菌體治療組、噬菌體對照組小鼠白細(xì)胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（x2=4.128，P＞0.05）。實驗第2天，

13、空白對照組、膿毒癥對照組、抗生素治療組、噬菌體治療組、噬菌體對照組分別有0、12、7、2、0只小鼠血細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為陽性?？瞻讓φ战M、噬菌體治療組、噬菌體對照組小鼠血細(xì)菌培養(yǎng)陽性比顯著低于膿毒癥對照組（x2值為-30.0～30.0，P值均小于0.01）。抗生素治療組小鼠血細(xì)菌培養(yǎng)陽性比顯著高于空白對照組和噬菌體對照組（x2值分別為17.5、-17.5，P值均小于0.05）。實驗第2天，除噬菌體治療組小鼠腎組織外，空白對照組、噬菌體治療組、

14、噬菌體對照組小鼠各臟器組織細(xì)菌含量均為0，均顯著低于膿毒癥對照組（x2值為-9.0～9.0，P值均小于0.01）;抗生素治療組小鼠腎組織細(xì)菌含量顯著高于空白對照組和噬菌體對照組（x2值分別為-7.5、7.5，P值均小于0.05）。
　　結(jié)論：
　　通過篩選得到的泛耐藥鮑曼不動桿菌裂解性噬菌體作為抗菌劑，用于噬菌體治療小鼠泛耐藥鮑曼不動桿菌所致膿毒癥，能明顯提高膿毒癥小鼠生存率，控制炎癥反應(yīng)，證明了泛耐藥鮑曼不動桿菌噬菌體運(yùn)用