裂解性噬菌體對(duì)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜的作用研究.pdf

1、鮑曼不動(dòng)桿菌是造成呼吸系統(tǒng)感染的常見(jiàn)條件致病菌，隨著多重耐藥甚至泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的出現(xiàn)，臨床鮑曼不動(dòng)桿菌感染的治療面臨極大挑戰(zhàn)。大部分鮑曼不動(dòng)桿菌菌株能夠形成生物被膜，在增強(qiáng)細(xì)菌存活能力的同時(shí)也進(jìn)一步提高了細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受能力，因此，抑制或清除生物被膜是應(yīng)對(duì)細(xì)菌耐藥的重要策略之一。裂解性噬菌體能夠特異感染并裂解宿主細(xì)菌，其作用機(jī)制與抗生素不同，在抗生素耐藥日益嚴(yán)重的今天又重新受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注，被認(rèn)為是治療耐藥菌感染的有效補(bǔ)充或替

2、代手段。
　　本研究以呼吸監(jiān)護(hù)室病人痰標(biāo)本中分離的1株泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌為指示菌，從解放軍第307醫(yī)院污水中分離出1株裂解性噬菌體。在完成基本生物學(xué)鑒定和全基因組序列分析后，采用體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)觀察了噬菌體對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜的作用效果。
　　為了研究該噬菌體的基本生物學(xué)特性，用雙層瓊脂法觀察噬菌斑大小和形態(tài)，透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，測(cè)定噬菌體的裂解譜及其一步生長(zhǎng)曲線。為了進(jìn)一步了解噬菌體的遺傳信息，用高通量測(cè)序的

3、方法得到噬菌體的全基因組序列并進(jìn)行基因注釋和同源性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，噬菌體感染宿主菌后，可在雙層瓊脂平板上形成圓形且透亮的噬菌斑，噬菌斑周圍可見(jiàn)明顯的暈環(huán)，說(shuō)明噬菌體在感染過(guò)程中可產(chǎn)生類似解聚酶的物質(zhì);透射電子顯微鏡觀察可見(jiàn)噬菌體呈直徑約為48～50nm的正六面體頭部和長(zhǎng)度約為140～150nm的可收縮長(zhǎng)尾，形態(tài)類似肌尾噬菌體科（Myoviridae）;該噬菌體可裂解包括宿主菌在內(nèi)的9株(9/31)耐碳青酶烯類鮑曼不動(dòng)桿菌且具有較短的

4、潛伏期(10min)和較大的爆發(fā)量（229pfu/cell）;噬菌體的全基因組為線性雙鏈DNA分子，長(zhǎng)度為41243bp，G+C含量為39.3％，編碼52個(gè)ORFs，16個(gè)ORFs編碼已知功能蛋白，不含整合酶、毒力因子或類轉(zhuǎn)座子等成分，與鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體AB3，F(xiàn)ri1，Abp1，phiAB1和vB_AbaP_PD-6A3的全基因組序列高度同源。
　　為了觀察噬菌體對(duì)細(xì)菌生物被膜的作用效果，體外培養(yǎng)鮑曼不動(dòng)桿菌形成生物被膜后，利

5、用掃描電子顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡、結(jié)晶紫染色半定量、生物被膜細(xì)菌計(jì)數(shù)以及生物被膜細(xì)菌ATP測(cè)定等方法評(píng)價(jià)噬菌體的作用效果。顯微鏡觀察結(jié)果表明，裂解性噬菌體能夠顯著破壞耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜。細(xì)菌定量結(jié)果表明噬菌體可以有效抑制88.5％的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌形成生物被膜，能夠清除52％～90％的生物被膜。ATP釋放實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明了裂解性噬菌體可以感染并破壞細(xì)菌生物被膜，進(jìn)入生物被膜細(xì)菌內(nèi)部并使之裂解。除此以外，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)

6、期的鮑曼不動(dòng)桿菌，還是鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜，同樣會(huì)對(duì)噬菌體的感染產(chǎn)生耐受，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)裂解性噬菌體的不敏感突變(BIM)率為3×10-6cfu。
　　綜上所述，本研究成功分離到耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌裂解性噬菌體，鑒定了該噬菌體的基本生物學(xué)特性和基因組成分，證明了噬菌體不僅能夠有效殺滅宿主菌，而且能夠抑制并破壞宿主菌形成生物被膜，為耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染的治療提供了新思路，具有一定的應(yīng)用前景。然而，在本研究中也發(fā)現(xiàn)了一些亟待解