IBDV配體表位P22-P221多肽合成功能鑒定及對(duì)CEF細(xì)胞文庫(kù)的篩選.pdf

1、雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是感染雞的高致病性并具有接觸性的傳染病。雞的法氏囊是該病毒侵染的靶器官。IBDV經(jīng)典毒株可感染3到6周齡的雛雞,造成免疫缺陷,進(jìn)而引起其它病原的感染,出現(xiàn)高死亡率,導(dǎo)致養(yǎng)禽業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。IBDV基因組編碼5種病毒蛋白,其中,VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)的蛋白,具有重要的作用。根據(jù)目前對(duì)IBDV VP2蛋白的研究,結(jié)合VP2蛋白的空間立體結(jié)構(gòu),本課題組設(shè)計(jì)合成

2、了一系列VP2多肽。對(duì)該系列VP2配體多肽進(jìn)行了篩選和鑒定,證實(shí)多肽P22是IBDV的配體結(jié)合表位,對(duì)多肽P22深入分析,得到多肽P22的主要顯效部分P221,并具有和多肽P22相同作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成多肽P22和P221,在DT40細(xì)胞進(jìn)行配體表位的研究,進(jìn)一步應(yīng)用配體表位多肽和病毒進(jìn)行受體篩選。
　　 本試驗(yàn)為深入研究多肽的生物學(xué)功能及用于IBDV的受體研究,用多肽合成儀固相合成多肽P22和P221,并用質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定,再用生

3、物素(Biotin)標(biāo)記多肽與CEF細(xì)胞結(jié)合的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證P22/P221多肽的生物學(xué)功能,證明了本次多肽合成的正確性。
　　 IBDV具有感染雛雞B淋巴細(xì)胞的功能,本實(shí)驗(yàn)用合成多肽通過(guò)Biotin-Avidin-HRP系統(tǒng)分別進(jìn)行在DT40細(xì)胞上的結(jié)合試驗(yàn)和病毒阻斷結(jié)合試驗(yàn),檢測(cè)合成多肽在雛雞B淋巴細(xì)胞系(DT40細(xì)胞)上的作用效果。試驗(yàn)結(jié)果初步說(shuō)明:多肽P22和多肽P221能夠有效地結(jié)合DT40細(xì)胞,且隨著多肽濃度的變化,結(jié)合

4、率也隨之相應(yīng)變化。經(jīng)病毒阻斷細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),多肽P22和多肽P221依然能夠有效和DT40細(xì)胞結(jié)合,但是比起細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果,結(jié)合率有明顯的下降,經(jīng)計(jì)數(shù)結(jié)合率約下降70％(P22)和50％(P221)。初步證明IBDV能夠有效阻斷P22和P221多肽結(jié)合DT40細(xì)胞。說(shuō)明多肽P22和P221與雞B淋巴細(xì)胞系能夠結(jié)合,對(duì)深入了解IBDV病毒與靶細(xì)胞的相互作用具有一定意義。
　　 為研究IBDV病毒與靶細(xì)胞的相互作用基礎(chǔ),篩選靶細(xì)

5、胞與IBDV的作用分子,分別使用P22和P221混合多肽與IBDV病毒(Xin—1)作為配基,對(duì)本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)制備的CEF細(xì)胞cDNA T7原核表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行三輪篩選,親和噬菌體的滴度基本穩(wěn)定。IBDV篩選三輪的噬菌體滴度分別為:5.3×103pfu/mL、3.7×106pfu/mL、1.7×106pfu/mL,投入產(chǎn)出比分別為1.9×107、2.7×104、5.8×104。P22篩選三輪的噬菌體滴度分別為:7.0×103pfu/mL、2.

6、1×106pfu/mL、1.3×106pfu/mL,投入產(chǎn)出比分別為1.4×107、4.7×104、7.6×104。通過(guò)Phage—ELISA和噬菌斑印跡法初步證明了親和噬菌體表達(dá)蛋白與病毒之間的相互作用。挑選可與IBDV病毒結(jié)合的親和噬菌斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序。經(jīng)Blast軟件分析,由IBDV作為配體篩選出來(lái)的親和噬菌體外源插入序列位于原雞cDNA序列CHEST898p20上,其最高同源性為97％；由混合多肽作為配體篩選出來(lái)的親和噬菌體

7、外源插入序列位于原雞膠原蛋白Ⅰ型α2鏈的mRNA上,其最高同源性為97％。這些序列表達(dá)蛋白可能會(huì)是CEF細(xì)胞上的IBDV病毒受體結(jié)合位點(diǎn),為下一步深入研究IBDV病毒受體表位奠定了基礎(chǔ)。
　　 本試驗(yàn)成功合成IBDV的配體結(jié)合表位多肽P22和P221,并證實(shí)其可同CEF細(xì)胞有效結(jié)合。通過(guò)結(jié)合試驗(yàn)和病毒阻斷結(jié)合試驗(yàn)表明多肽P22和P221可有效和DT40細(xì)胞結(jié)合,并證明IBDV病毒可阻斷多肽和DT40細(xì)胞的結(jié)合。進(jìn)一步分別應(yīng)用配體