生殖支原體MgPa特異性結(jié)合多肽的篩選、鑒定與人尿道上皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、生殖支原體（Mycoplasma genitalium，Mg）是介于病毒與細(xì)菌之間、缺乏細(xì)胞壁、呈高度多型性，可在無(wú)生命培養(yǎng)基中繁殖的原核細(xì)胞型微生物，可引起泌尿生殖系統(tǒng)感染，被歸類于性傳播疾病病原體之一。近年來(lái)，Mg感染率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但目前仍然沒(méi)有滿足臨床需要的藥物和疫苗可供使用。Mg最關(guān)鍵的外膜粘附蛋白為生殖支原體粘附素蛋白（MgPa），其C端具有較強(qiáng)的免疫原性，自發(fā)性的無(wú)細(xì)胞黏附活性的Mg突變株則缺乏 MgPa，因此，MgPa在

2、 Mg的致病性方面起著至關(guān)重要的作用。本研究利用構(gòu)建好的原核表達(dá)載體PET-30a(+)／MgPa在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)MgPa的重組蛋白（rMgPa），采用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)技術(shù)篩選MgPa重組蛋白的特異性結(jié)合多肽，并對(duì)篩選到的特異性多肽進(jìn)行鑒定。
　　本研究目的：1、利用課題組前期構(gòu)建好的含生殖支原體粘附素蛋白（MgPa）優(yōu)勢(shì)表位（1075～1364 aa）的重組載體，表達(dá)并純化MgPa，為研究 MgPa的生物學(xué)功能奠定前期實(shí)驗(yàn)

3、基礎(chǔ)。2、利用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)篩選并鑒定 MgPa的特異性結(jié)合多肽，為研究MgPa的致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3、構(gòu)建人尿道上皮細(xì)胞（SV-HUC-1）的T7噬菌體展示cDNA文庫(kù)，為研究人尿道上皮細(xì)胞與生殖支原體的相互作用奠定基礎(chǔ)。
　　本研究方法：1、利用課題組前期構(gòu)建好的含生殖支原體粘附素蛋白（MgPa）優(yōu)勢(shì)表位（1075～1364aa）重組載體（rMgPa）的重組菌株，用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá) rMgPa，用SDA-PAGE和W

4、estern blot進(jìn)行分析與鑒定，再經(jīng)Ni-NAT親和層析純化柱純化重組蛋白，最后用 BCA法測(cè)定其濃度。2、以rMgPa為靶分子，對(duì)噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)和7肽庫(kù)進(jìn)行3輪生物淘選，收集淘選后的噬菌體，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，利用碘化鈉法提取并純化噬菌體克隆的單鏈 DNA，并進(jìn)行 DNA測(cè)序分析，推導(dǎo)出展示在噬菌體表面的外源性氨基酸序列。用 ELISA、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)和斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)陽(yáng)性噬菌體與 rMgPa結(jié)合的特異性。3、用Tr

5、izol試劑提取SV-HUC-1細(xì)胞總RNA，分離純化出mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成得到其雙鏈 cDNA，在雙鏈 cDNA末端加上定向的EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端，然后收集并純化200bp以上的雙鏈cDNA片段，連接于T7噬菌體載體，經(jīng)體外包裝后轉(zhuǎn)入 BLT5403宿主菌，構(gòu)建成T7噬菌體展示cDNA文庫(kù)。
　　本研究結(jié)果:1、SDS-PAGE顯示，MgPa的重組菌株在 IPTG誘導(dǎo)下成功表達(dá)出一分子量約為37kD的目的蛋白（含6×

6、His），利用 Ni-NAT純化柱純化后獲得了純度較高的目的蛋白，用 BCA法經(jīng)核酸蛋白儀測(cè)定，其濃度達(dá)到1900μg/mL。2、利用rMgPa對(duì)噬菌體展示隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行3輪生物淘選，第一輪至第三輪淘選的產(chǎn)率依次為1.78×10-6、8.0×10-6、7.3×10-5，說(shuō)明噬菌體克隆有明顯富集；隨機(jī)挑取了38個(gè)噬菌體克隆擴(kuò)增，提取單鏈 DNA進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明38個(gè)噬菌體展示外源肽序列中有2組一致性的核心序列，分別為：V-H-W-

7、D-F-R-Q-W-W-Q-P-S和D-W-S-S-W-V-Y/H-R-D-P-Q-T/S。噬菌體展示隨機(jī)7肽庫(kù)中篩選到了一條核心序列：H-Y-I-D-F-R-W。3、 ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：在從噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)中篩選到的11個(gè)代表性克隆中，有10個(gè)（P1～P10）與rMgPa的結(jié)合較高，為陽(yáng)性噬菌體克隆；競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，10個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆與 rMgPa重組蛋白的特異性結(jié)合能被不同稀釋比例的抗 rMgPa抗體部分抑制，

8、且隨著其稀釋比例的增加其抑制效果相應(yīng)的下降；斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)陽(yáng)性噬菌體均能與 rMgPa發(fā)生特異性結(jié)合。4、將文庫(kù)擴(kuò)增后，用噬斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè) SV-HUC-1細(xì)胞 T7噬菌體展示 cDNA文庫(kù)的庫(kù)容，結(jié)果為1.2×106pfu/cm3；用 PCR鑒定隨機(jī)挑取的噬菌斑，計(jì)算其重組率達(dá)93.75％，且插入片段都大于200bp。
　　本研究結(jié)論：1、成功表達(dá)并純化出了分子量為37kD、濃度為1900μg/mL的重組蛋白 rMgPa。2、成功