氟康唑和多西環(huán)素聯(lián)合對CA和SE混合生物膜的作用及機(jī)制研究.pdf

1、生物膜是一種附著于人體組織或生物醫(yī)療器材表面，由胞外基質(zhì)包裹細(xì)胞而產(chǎn)生的一種或多種生物群體。近年來，隨著惡性腫瘤、自身免疫病、艾滋病等發(fā)病率的升高，廣譜抗生素、皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的廣泛使用，使得真菌感染的發(fā)病率不斷上升，特別由于呼吸機(jī)等醫(yī)療生物材料的大量應(yīng)用，生物膜相關(guān)性真菌的感染發(fā)生率不斷增加。臨床上生物膜感染常常涉及混合感染，白色念珠菌是第四位引起醫(yī)院血流感染和第三位引起導(dǎo)管插管感染的分離真菌，它的致死率高達(dá)62％。表皮葡萄球菌是

2、滋生于人體表皮的正常菌群類型，也是醫(yī)院交叉感染的重要來源，它易于在生物材料上形成生物膜而成為醫(yī)用生物材相關(guān)感染的主要致病菌。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白色念珠菌和表皮葡萄球菌的感染同時(shí)存在時(shí)，常常涉及混合生物膜的形成，從而導(dǎo)致感染反復(fù)發(fā)作而難以治愈，因此尋找治療白色念珠菌和表皮葡萄球菌混合生物膜感染的途徑倍受關(guān)注。
　　 近來氟康唑在臨床上廣泛應(yīng)用于白色念珠菌感染的治療，但隨著氟康唑應(yīng)用的增多，白色念珠菌的耐藥性不斷出現(xiàn)?，F(xiàn)有臨床可用的抗真菌

3、藥物不僅品種有限，且價(jià)格昂貴，毒副作用大，于是通過采用非抗真菌藥物與氟康唑聯(lián)合的方法來增加氟康唑?qū)Π咨钪榫拿舾行浴Ｔ诒菊n題預(yù)實(shí)驗(yàn)的過程中，初步發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素與氟康唑聯(lián)用對白色念珠菌有一定的協(xié)同抗真菌作用。多西環(huán)素和氟康唑聯(lián)用對生物膜，特別是白色念珠菌和表皮葡萄球菌形成的混合生物膜是否同樣具有協(xié)同作用，作用強(qiáng)度、特征及機(jī)制等都有待于進(jìn)一步研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究多西環(huán)素和氟康唑聯(lián)合對白色念珠菌和表皮葡萄球菌混合生物膜的體外作用，

4、并從耐藥基因表達(dá)、胞內(nèi)鈣水平變化和細(xì)胞周期改變?nèi)齻€(gè)方面探討機(jī)制。希望通過作用研究為臨床治療混合生物膜的感染提供思路，通過機(jī)制研究為抗感染藥物開發(fā)新靶點(diǎn)提供線索。
　　 1.適合白色念珠菌和表皮葡萄球菌生長的培養(yǎng)基篩選
　　 在固體培養(yǎng)基的篩選上，以平板劃線法，觀察加入不同的營養(yǎng)成分配比后白色念珠菌和表皮葡萄球菌的菌落24h和48h生長狀態(tài)。同時(shí)觀察加入羊血和鈣離子對生長的影響，發(fā)現(xiàn)兩者不能同時(shí)促進(jìn)真菌和細(xì)菌的生長。最終確

5、定以下配比為最佳:酵母膏0.25％，牛肉粉0.25％，蛋白胨1.25％，瓊脂粉1.625％，葡萄糖0.5％和氯化鈉0.375％。在液體培養(yǎng)基的篩選上，將菌液和不同配比的培養(yǎng)基成分加入96孔板中，觀察24h和48h生長結(jié)果，最終確定以下配比為最適合真菌和細(xì)菌生長的液體培養(yǎng)基:RPMI16400.52％，MOPS1.7265％，碳酸氫鈉0.1％，葡萄糖0.225％，胰蛋白胨0.85％，植物蛋白胨0.15％，氯化鈉0.25％，磷酸氫二鉀0.1

6、25％。通過以上適合真菌和細(xì)菌共同生長固體和液體培養(yǎng)基成分的篩選，為接下來藥物聯(lián)用對混合生物膜作用和機(jī)制的研究作準(zhǔn)備。
　　 2.氟康唑和多西環(huán)素聯(lián)合抗白色念珠菌生物膜的作用
　　 本實(shí)驗(yàn)按照CLSIM27-A3方案，通過微量稀釋法測定了一定濃度多西環(huán)素(0.5-64μg/mL)和氟康唑聯(lián)用對十株不同敏感性的白色念珠菌浮游及生物膜狀態(tài)的作用，并比較了聯(lián)合藥物對經(jīng)過三個(gè)成膜時(shí)間（4，8和12h）形成的生物膜的影響。通過XT

7、T法測定藥物作用后混合生物膜的活性，F(xiàn)ICI和△E兩種模型用于評價(jià)藥物的相互作用。結(jié)果表明，對于浮游菌來說，協(xié)同作用隨著菌株的耐藥程度不同而不同:對耐藥和劑量依耐性敏感菌株表現(xiàn)出強(qiáng)協(xié)同作用，而對敏感菌株表現(xiàn)出無關(guān)作用;對于生物膜來說，藥物聯(lián)用對所有菌株的各個(gè)成膜時(shí)間形成的生物膜均表現(xiàn)出協(xié)同作用，作用隨著成膜時(shí)間的增長而減弱，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)藥物對生物膜的作用弱于浮游菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對于尋找新的抗真菌制劑和臨床上克服白色念珠菌生物膜感染具有一定

8、的意義。
　　 3.氟康唑和多西環(huán)素聯(lián)合抗白色念珠菌和表皮葡萄球菌混合生物膜的作用
　　 本實(shí)驗(yàn)以不同敏感程度的白色念珠菌和表皮葡萄球菌形成生物膜，以微量稀釋法測定氟康唑和多西環(huán)素聯(lián)用對混合生物膜的作用，以浮游菌的作用結(jié)果做對照。通過XTT法測定藥物作用后混合生物膜的活性，以FICI法和△E法分析藥物聯(lián)合作用的結(jié)果，并討論結(jié)果的一致性。結(jié)果表明，氟康唑和多西環(huán)素聯(lián)用對各種耐藥程度組合的浮游菌和生物膜都表現(xiàn)出協(xié)同作用，作用

9、程度的強(qiáng)弱主要和白色念珠菌的耐藥性有關(guān)，藥物對于耐藥白色念珠菌組成的混合生物膜作用弱于敏感菌，由此可以推測聯(lián)合藥物對混合生物膜的協(xié)同作用主要針對白色念珠菌。
　　 4.藥物聯(lián)用對混合生物膜內(nèi)白色念珠菌和表皮葡萄球菌各自作用的評價(jià)
　　 為了進(jìn)一步證明聯(lián)合藥物對混合生物膜內(nèi)白色念珠菌和表皮葡萄球菌各自生長的影響，本實(shí)驗(yàn)利用選擇性適合白色念珠菌和表皮葡萄球菌生長的TTC-沙保羅培養(yǎng)基和甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基，將藥物作用前后的混

10、合浮游和生物膜內(nèi)的真菌和細(xì)菌分離，用菌落計(jì)數(shù)法測定各菌株的量變，以此評價(jià)藥物對各菌株生長的作用。結(jié)果表明，影響白色念珠菌數(shù)量的主要原因是藥物聯(lián)用的協(xié)同作用和營養(yǎng)限制，而影響表皮葡萄球菌數(shù)量的主要原因是營養(yǎng)限制和多西環(huán)素的作用，由此推測藥物的協(xié)同作用主要是針對白色念珠菌，進(jìn)一步驗(yàn)證了上一章的結(jié)果。
　　 5.藥物聯(lián)用對混和生物膜內(nèi)白色念珠菌耐藥基因表達(dá)的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)以普通逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscrip

11、tionPCR)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimePCR)分別測定單獨(dú)生物膜（單膜）和混合生物膜（混膜）內(nèi)白色念珠菌耐藥基因CDR1、CDR2和MDR1的表達(dá)，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果用2-△△Ct法分析。結(jié)果表明，單膜和混膜內(nèi)白色念珠菌耐藥基因的表達(dá)情況相似，對于CDR1和MDR1基因，多西環(huán)素單用和生長對照的表達(dá)無顯著差異，氟康唑單用可引起基因過度表達(dá)，當(dāng)多西環(huán)素和氟康唑聯(lián)用后表達(dá)顯著降低;對于CDR2基因，相較于生長對照組

12、，多西環(huán)素單用引起基因表達(dá)顯著降低，單膜和混膜的氟康唑單用結(jié)果不一致（單膜內(nèi)引起基因過度表達(dá)，混膜則無顯著改變），但是藥物聯(lián)用較氟康唑單用的表達(dá)水平均顯著降低。由此可以推測，藥物聯(lián)用的協(xié)同作用和阻滯了白色念珠菌外排泵編碼基因CDR1、CDR2和MDR1的過度表達(dá)有關(guān)。
　　 6.藥物聯(lián)用對混和生物膜內(nèi)白色念珠菌內(nèi)鈣水平的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)首先以平板劃線法評價(jià)鈣通道阻滯劑（貝尼地平和硝苯地平）對氟康唑和多西環(huán)素的協(xié)同作用的

13、影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鈣通道被阻滯后，聯(lián)合藥物的協(xié)同作用增強(qiáng)，于是推測協(xié)同作用的發(fā)生機(jī)制和鈣相關(guān)，為了進(jìn)一步驗(yàn)證推測，我們選擇新一代鈣離子敏感的熒光探針Fluo-3AM，以熒光顯微鏡初步觀察藥物作用對胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，以流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步定量評價(jià)聯(lián)合藥物作用后胞內(nèi)鈣離子濃度的改變，結(jié)果表明，生長對照和多西環(huán)素單用均對白色念珠菌的胞內(nèi)鈣離子濃度不產(chǎn)生影響;氟康唑單用4h后胞內(nèi)鈣離子急劇升高，且在8h時(shí)達(dá)到最高值;藥物聯(lián)用組同樣在作用4h后引起鈣

14、離子快速升高，但在8h后開始緩慢上升，并高于氟康唑單用組。對照白色念珠菌單膜和混膜的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥物引起的鈣離子變化沒有明顯差異。由此推測，氟康唑和多西環(huán)素聯(lián)用的機(jī)制和加速了白色念珠菌胞內(nèi)鈣離子紊亂有關(guān)。
　　 7.藥物聯(lián)用對混合生物膜內(nèi)白色念珠菌細(xì)胞周期的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)以流式細(xì)胞術(shù)測定藥物聯(lián)用對單膜和混膜內(nèi)白色念珠菌細(xì)胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于單膜，氟康唑單用和藥物聯(lián)用組均導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G2/M期，氟康唑單用的作用強(qiáng)

15、于藥物聯(lián)用;對于混合生物膜，生長對照，多西環(huán)素、氟康唑單用，兩藥聯(lián)用組的細(xì)胞周期差異不顯著，由此看來，氟康唑本身可以阻滯白色念珠菌的細(xì)胞周期，而藥物聯(lián)合并不是通過影響細(xì)胞周期發(fā)揮協(xié)同作用的。同時(shí)我們對照單膜和混膜內(nèi)白色念珠菌細(xì)胞周期的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和表皮葡萄球菌混合生長的白色念珠菌表現(xiàn)出顯著的G2/M期阻滯，也就是說混合生物膜內(nèi)的白色念珠菌的活力和生長狀態(tài)受到抑制。
　　 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)氟康唑和多西環(huán)素聯(lián)用對白色念珠菌和表皮葡萄