富含脂肪干細胞微?；净|治療糖尿病潰瘍的研究.pdf

1、目的:
　　從2005年脂肪來源干細胞(Adipose-derived stem/stromal cell，ASC)被證實其間充質多向分化能力后[1]，其分泌營養(yǎng)因子、免疫調節(jié)、促血管化能力逐步被認識，又因其來源豐富和容易獲取的特點，利用脂肪干細胞及相關細胞產品注冊的臨床試驗呈現(xiàn)了對數(shù)增長的勢態(tài)[2-4]。脂肪干細胞療法的主要應用之一就是治療各種類型的慢性軟組織損傷。數(shù)據(jù)顯示，各個時期的世界范圍內均有約1％人口受各種遷延不愈的慢性

2、潰瘍的折磨[5]。而干細胞干預在許多動物實驗中被證實可在創(chuàng)面分泌生長因子，改善慢性炎癥、啟動體內愈合過程，并有小部分細胞直接分化整合長入創(chuàng)面，從而為各類慢性潰瘍的治療提供了新的選擇[2，4，6]。
　　也正是由于成人干細胞的多向分化和遷移行為并未被科學家完全了解，其臨床應用的實施者并不能對移植后的干細胞行為進行有效的干預和調控。為了避免如感染、干細胞異常異位分化增殖，甚至惡變等潛在風險，諸多國家紛紛頒布了細胞療法/藥物的相關法規(guī)[

3、7]。法規(guī)中相似的是，對于化學藥品（如膠原蛋白酶）和動物源性制劑（如胎牛血清）提純培養(yǎng)后的干細胞療法，采用了極為嚴格的倫理和安全審查制度。即使脂肪來源干細胞對于自身免疫、慢性創(chuàng)傷等疾病的治療作用逐步被認可，臨床上使用提純后細胞產品仍然存在很大的不確定性，偶見并發(fā)癥及不良事件報道，而仍需謹慎對待及規(guī)范化。因此，2015年8月，國家衛(wèi)計委聯(lián)合藥監(jiān)局發(fā)布《干細胞臨床研究管理辦法（試行）》，界定提取培養(yǎng)干細胞及基質血管成分為“第三類醫(yī)療技術”并

4、出臺一系列審批監(jiān)管制度。
　　目前臨床試驗最受歡迎的脂肪干細胞產品（如培養(yǎng)后脂肪來源干細胞，基質血管成分）均包含了涉及了膠原酶消化或體外培養(yǎng)的步驟，故該類細胞療法的臨床轉化仍存在審批周期長、經費花費多、儀器及環(huán)境要求高等困難。于是，在本課題中我們旨在為慢性軟組織損傷，如糖尿病足，設計一種脂肪來源干細胞產品，制備方法不使用違規(guī)的化學藥品或動物來源制劑，既在產品中富集了干細胞，又能比上述細胞產品有更好的安全性，并且簡單易行還可通過微創(chuàng)

5、的方式移植。
　　方法與結果：
　　利用脂肪組織內既含有細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)支架又含有脂肪來源干細胞的固有特性，我們將脂肪組織利用物理方法微粒化（剪碎），經PBS震蕩沖洗后利用脂肪和其中纖維組織的密度差，通過離心得到沉淀物，進而獲取其中的結締組織和細胞成分作為治療用產品。離心后，脂肪組織被分成多數(shù)的上層的漂浮物和下層白色沉淀物。掃描電子顯微鏡對于沉淀物的形態(tài)觀察顯示，產品中的確存在大

6、量脂肪細胞外基質成分，而罕有成熟脂肪細胞，主要脂肪細胞留在了離心后的脂肪結構保存完好的漂浮物中;全組織染色（分別利用小麥胚芽凝集素、凝集素lectin和Hoechst染色指示脂肪細胞、血管和有核細胞）及共聚焦顯微鏡掃描顯示了其功能性成分:該產品通過除去脂肪細胞而富集了脂肪內基質細胞，還可見枝杈結構保存較完整的豐富的血管及毛細血管成分;通過經典的膠原蛋白酶消化法及流式細胞術，我們對比了全脂肪組織機制血管成分與本產品的細胞成分，結果顯示本產

7、品不僅濃縮了細胞，而且含有脂肪基質血管成分的全部種類細胞:脂肪來源干細胞（CD45-，CD34+，CD31-），血管內皮細胞(CD45-，CD31+)，血源性細胞(CD45+)等。雖然膠原酶對于本產品的消化效率相對于普通脂肪抽吸物效率欠佳，其內皮細胞釋放量僅占0.7％（普通基質血管成分提取約6.7％），微粒化含細胞脂肪基質經過消化后提純的脂肪來源干細胞的比例仍可達到約13％（普通基質血管成分提取約38.2％）。但與同等體積的脂肪組織相比

8、，大大提高了產品脂肪來源干細胞濃度。
　　因該產品的細胞外基質和干細胞成分，我們將其命名為微?；毎净|(Micronized cellular adipose matrix，MCAM)。利用對人脂肪抽吸物的處理，我們同時獲取了膠原酶消化提取的脂肪來源干細胞，和微?；毎净|來源的脂肪干細胞。體外培養(yǎng)擴增后其分化誘導實驗顯示，二者均具有活性，并具有間充質分化能力（成脂、成骨、成軟骨），分化能力無論是從定性實驗（三系誘導

9、培養(yǎng)液分別誘導實驗組21天后，尼羅紅、von Kossa、阿爾新蘭染色分別為陽性，誘導后兩組細胞形態(tài)無明顯區(qū)別，培養(yǎng)基誘導對照組無陽性染色，每系誘導/對照組包含3個獨立樣品）還是定量實驗:成脂誘導的脂質沉積試驗吸光度差別(p=0.497)，成骨誘導的鈣沉積結合吸光度定量差(p=0.903)，還有干細胞微球成軟骨誘導后微球分泌膠原蛋白直徑增大程度差別均不顯著，證實了MCAM中的脂肪干細胞具有活性、擴增和間充質分化能力。
　　最后，我

10、們選擇了二型糖尿病db/db小鼠的潰瘍模型測試MCAM的治療效果。首先采用普通C57小鼠單側腹股溝脂肪剪碎制作治療單個潰瘍所需的微?；毎净|。db/db小鼠背部制作了6mm圓形背部全層皮膚損傷，為防止鼠皮膚收縮愈合，創(chuàng)口周圍采用鋒線將周圍皮膚固定于圈形硅膠支架。術后即采用了創(chuàng)緣點狀局部皮下注射治療。分為MCAM治療組和PBS治療組，每組包含4個潰瘍。分別于不同時間點觀察潰瘍創(chuàng)傷床面積縮小情況，每次觀察時消毒并以清潔敷料覆蓋。通過

11、監(jiān)測其愈合過程，我們發(fā)現(xiàn)MCAM治療組損傷愈合的修復/增殖期，即術后第4日較對照組傷口面積小64％(p=0.0082)和第7日比對照組小65％(p=0.0043)，具有顯著差異。接近2周的終點時，MCAM治療組基本愈合，而PBS組創(chuàng)面愈合欠佳，上皮覆蓋較薄，創(chuàng)傷床仍較充血。此實驗提示我們微?；毎净|在二型糖尿病潰瘍的創(chuàng)傷修復中，有加速了創(chuàng)面的愈合的作用。
　　討論：
　　不僅是糖尿病性潰瘍，所有慢性潰瘍的遷延不愈都是

12、整形外科的難題之一。研究顯示其難愈主要有以下兩種機制:軟組織固有的間充質和/或上皮干細胞的缺失和功能失效（如放射性損傷后及糖尿病等）;還有局部長期缺血缺氧、慢性炎癥浸潤，即微環(huán)境的“貧瘠化”（如糖尿病、壓瘡和外周血管病導致的潰瘍）。脂肪來源干細胞在移植后具有增殖分化能力，并抑制炎癥、分泌促血管化生長因子，被認為對上述病理情況都有針對性作用[8]。與此同時，脂肪的細胞外基質成分也被證實了生物學活性和調節(jié)局部過度炎癥的作用，更是為脂肪干細胞

13、提供了干細胞巢(Niche)[4，9]，首先保證了脂肪干細胞移植后不被迅速攝取破壞，另外存在于固有細胞巢中的脂肪干細胞的異常分化可能大大減少，并且提供了干細胞攀附的支架，防止了其異位遷徙。所以我們認為微?；毎净|的產品，不僅包含了脂肪干細胞的生物學功能，更是因為其基質成分的存在而保護了干細胞，同常見的干細胞懸液直接注射的方式相比，提高了細胞移植的效率及安全性，更適用于前述慢性軟組織損傷的修復再生。
　　據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會最

14、新發(fā)布《糖尿病地圖》顯示，我國有1.14億糖尿病患者，而其中15％會在病程中出現(xiàn)糖尿病潰瘍。采用臨床常規(guī)療法，如各種生物敷料等，常常需要長期換藥護理，由于局部皮膚卻學狀況無改善，故效果不甚理想。而相關間充質/脂肪來源干細胞臨床試驗則為患者帶來明顯受益[10，11]。對于干細胞療法應用慢性創(chuàng)面治療有著巨大市場，不同類型規(guī)模的醫(yī)療機構加入其中導致臨床研究和治療領域常常不能滿足《藥品生產質量管理規(guī)范》，即GMP要求。而微?；毎净|具有

15、制備簡單的優(yōu)勢，相信經過制備方法的改善，可在手術臺上完成并于同一操作中進行治療。而該濃縮干細胞產物，由于只經過了“最低限度處理”，而規(guī)避了干細胞療法的許多潛在風險，無需審批手續(xù)，而便于臨床推廣應用。
　　結論：
　　微?；毎净|是自體/異體來源的、由生物活性細胞外基質和活細胞構成的、可注射（100-400μm顆粒）的脂肪處理產物。其制作方法符合法規(guī)對于臨床醫(yī)生可處理并行組織/細胞移植的要求。本課題中，我們測試了微?；?/p>