富含脂肪干細(xì)胞微粒化脂肪基質(zhì)治療糖尿病潰瘍的研究.pdf

1、目的:
　　從2005年脂肪來源干細(xì)胞(Adipose-derived stem/stromal cell，ASC)被證實(shí)其間充質(zhì)多向分化能力后[1]，其分泌營(yíng)養(yǎng)因子、免疫調(diào)節(jié)、促血管化能力逐步被認(rèn)識(shí)，又因其來源豐富和容易獲取的特點(diǎn)，利用脂肪干細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)品注冊(cè)的臨床試驗(yàn)呈現(xiàn)了對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的勢(shì)態(tài)[2-4]。脂肪干細(xì)胞療法的主要應(yīng)用之一就是治療各種類型的慢性軟組織損傷。數(shù)據(jù)顯示，各個(gè)時(shí)期的世界范圍內(nèi)均有約1％人口受各種遷延不愈的慢性

2、潰瘍的折磨[5]。而干細(xì)胞干預(yù)在許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)可在創(chuàng)面分泌生長(zhǎng)因子，改善慢性炎癥、啟動(dòng)體內(nèi)愈合過程，并有小部分細(xì)胞直接分化整合長(zhǎng)入創(chuàng)面，從而為各類慢性潰瘍的治療提供了新的選擇[2，4，6]。
　　也正是由于成人干細(xì)胞的多向分化和遷移行為并未被科學(xué)家完全了解，其臨床應(yīng)用的實(shí)施者并不能對(duì)移植后的干細(xì)胞行為進(jìn)行有效的干預(yù)和調(diào)控。為了避免如感染、干細(xì)胞異常異位分化增殖，甚至惡變等潛在風(fēng)險(xiǎn)，諸多國(guó)家紛紛頒布了細(xì)胞療法/藥物的相關(guān)法規(guī)[

3、7]。法規(guī)中相似的是，對(duì)于化學(xué)藥品（如膠原蛋白酶）和動(dòng)物源性制劑（如胎牛血清）提純培養(yǎng)后的干細(xì)胞療法，采用了極為嚴(yán)格的倫理和安全審查制度。即使脂肪來源干細(xì)胞對(duì)于自身免疫、慢性創(chuàng)傷等疾病的治療作用逐步被認(rèn)可，臨床上使用提純后細(xì)胞產(chǎn)品仍然存在很大的不確定性，偶見并發(fā)癥及不良事件報(bào)道，而仍需謹(jǐn)慎對(duì)待及規(guī)范化。因此，2015年8月，國(guó)家衛(wèi)計(jì)委聯(lián)合藥監(jiān)局發(fā)布《干細(xì)胞臨床研究管理辦法（試行）》，界定提取培養(yǎng)干細(xì)胞及基質(zhì)血管成分為“第三類醫(yī)療技術(shù)”并

4、出臺(tái)一系列審批監(jiān)管制度。
　　目前臨床試驗(yàn)最受歡迎的脂肪干細(xì)胞產(chǎn)品（如培養(yǎng)后脂肪來源干細(xì)胞，基質(zhì)血管成分）均包含了涉及了膠原酶消化或體外培養(yǎng)的步驟，故該類細(xì)胞療法的臨床轉(zhuǎn)化仍存在審批周期長(zhǎng)、經(jīng)費(fèi)花費(fèi)多、儀器及環(huán)境要求高等困難。于是，在本課題中我們旨在為慢性軟組織損傷，如糖尿病足，設(shè)計(jì)一種脂肪來源干細(xì)胞產(chǎn)品，制備方法不使用違規(guī)的化學(xué)藥品或動(dòng)物來源制劑，既在產(chǎn)品中富集了干細(xì)胞，又能比上述細(xì)胞產(chǎn)品有更好的安全性，并且簡(jiǎn)單易行還可通過微創(chuàng)

5、的方式移植。
　　方法與結(jié)果：
　　利用脂肪組織內(nèi)既含有細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)支架又含有脂肪來源干細(xì)胞的固有特性，我們將脂肪組織利用物理方法微?；羲椋?，經(jīng)PBS震蕩沖洗后利用脂肪和其中纖維組織的密度差，通過離心得到沉淀物，進(jìn)而獲取其中的結(jié)締組織和細(xì)胞成分作為治療用產(chǎn)品。離心后，脂肪組織被分成多數(shù)的上層的漂浮物和下層白色沉淀物。掃描電子顯微鏡對(duì)于沉淀物的形態(tài)觀察顯示，產(chǎn)品中的確存在大

6、量脂肪細(xì)胞外基質(zhì)成分，而罕有成熟脂肪細(xì)胞，主要脂肪細(xì)胞留在了離心后的脂肪結(jié)構(gòu)保存完好的漂浮物中;全組織染色（分別利用小麥胚芽凝集素、凝集素lectin和Hoechst染色指示脂肪細(xì)胞、血管和有核細(xì)胞）及共聚焦顯微鏡掃描顯示了其功能性成分:該產(chǎn)品通過除去脂肪細(xì)胞而富集了脂肪內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞，還可見枝杈結(jié)構(gòu)保存較完整的豐富的血管及毛細(xì)血管成分;通過經(jīng)典的膠原蛋白酶消化法及流式細(xì)胞術(shù)，我們對(duì)比了全脂肪組織機(jī)制血管成分與本產(chǎn)品的細(xì)胞成分，結(jié)果顯示本產(chǎn)

7、品不僅濃縮了細(xì)胞，而且含有脂肪基質(zhì)血管成分的全部種類細(xì)胞:脂肪來源干細(xì)胞（CD45-，CD34+，CD31-），血管內(nèi)皮細(xì)胞(CD45-，CD31+)，血源性細(xì)胞(CD45+)等。雖然膠原酶對(duì)于本產(chǎn)品的消化效率相對(duì)于普通脂肪抽吸物效率欠佳，其內(nèi)皮細(xì)胞釋放量?jī)H占0.7％（普通基質(zhì)血管成分提取約6.7％），微?；?xì)胞脂肪基質(zhì)經(jīng)過消化后提純的脂肪來源干細(xì)胞的比例仍可達(dá)到約13％（普通基質(zhì)血管成分提取約38.2％）。但與同等體積的脂肪組織相比

8、，大大提高了產(chǎn)品脂肪來源干細(xì)胞濃度。
　　因該產(chǎn)品的細(xì)胞外基質(zhì)和干細(xì)胞成分，我們將其命名為微粒化含細(xì)胞脂肪基質(zhì)(Micronized cellular adipose matrix，MCAM)。利用對(duì)人脂肪抽吸物的處理，我們同時(shí)獲取了膠原酶消化提取的脂肪來源干細(xì)胞，和微?；?xì)胞脂肪基質(zhì)來源的脂肪干細(xì)胞。體外培養(yǎng)擴(kuò)增后其分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示，二者均具有活性，并具有間充質(zhì)分化能力（成脂、成骨、成軟骨），分化能力無論是從定性實(shí)驗(yàn)（三系誘導(dǎo)

9、培養(yǎng)液分別誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組21天后，尼羅紅、von Kossa、阿爾新蘭染色分別為陽(yáng)性，誘導(dǎo)后兩組細(xì)胞形態(tài)無明顯區(qū)別，培養(yǎng)基誘導(dǎo)對(duì)照組無陽(yáng)性染色，每系誘導(dǎo)/對(duì)照組包含3個(gè)獨(dú)立樣品）還是定量實(shí)驗(yàn):成脂誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積試驗(yàn)吸光度差別(p=0.497)，成骨誘導(dǎo)的鈣沉積結(jié)合吸光度定量差(p=0.903)，還有干細(xì)胞微球成軟骨誘導(dǎo)后微球分泌膠原蛋白直徑增大程度差別均不顯著，證實(shí)了MCAM中的脂肪干細(xì)胞具有活性、擴(kuò)增和間充質(zhì)分化能力。
　　最后，我

10、們選擇了二型糖尿病db/db小鼠的潰瘍模型測(cè)試MCAM的治療效果。首先采用普通C57小鼠單側(cè)腹股溝脂肪剪碎制作治療單個(gè)潰瘍所需的微?；?xì)胞脂肪基質(zhì)。db/db小鼠背部制作了6mm圓形背部全層皮膚損傷，為防止鼠皮膚收縮愈合，創(chuàng)口周圍采用鋒線將周圍皮膚固定于圈形硅膠支架。術(shù)后即采用了創(chuàng)緣點(diǎn)狀局部皮下注射治療。分為MCAM治療組和PBS治療組，每組包含4個(gè)潰瘍。分別于不同時(shí)間點(diǎn)觀察潰瘍創(chuàng)傷床面積縮小情況，每次觀察時(shí)消毒并以清潔敷料覆蓋。通過

11、監(jiān)測(cè)其愈合過程，我們發(fā)現(xiàn)MCAM治療組損傷愈合的修復(fù)/增殖期，即術(shù)后第4日較對(duì)照組傷口面積小64％(p=0.0082)和第7日比對(duì)照組小65％(p=0.0043)，具有顯著差異。接近2周的終點(diǎn)時(shí)，MCAM治療組基本愈合，而PBS組創(chuàng)面愈合欠佳，上皮覆蓋較薄，創(chuàng)傷床仍較充血。此實(shí)驗(yàn)提示我們微?；?xì)胞脂肪基質(zhì)在二型糖尿病潰瘍的創(chuàng)傷修復(fù)中，有加速了創(chuàng)面的愈合的作用。
　　討論：
　　不僅是糖尿病性潰瘍，所有慢性潰瘍的遷延不愈都是

12、整形外科的難題之一。研究顯示其難愈主要有以下兩種機(jī)制:軟組織固有的間充質(zhì)和/或上皮干細(xì)胞的缺失和功能失效（如放射性損傷后及糖尿病等）;還有局部長(zhǎng)期缺血缺氧、慢性炎癥浸潤(rùn)，即微環(huán)境的“貧瘠化”（如糖尿病、壓瘡和外周血管病導(dǎo)致的潰瘍）。脂肪來源干細(xì)胞在移植后具有增殖分化能力，并抑制炎癥、分泌促血管化生長(zhǎng)因子，被認(rèn)為對(duì)上述病理情況都有針對(duì)性作用[8]。與此同時(shí)，脂肪的細(xì)胞外基質(zhì)成分也被證實(shí)了生物學(xué)活性和調(diào)節(jié)局部過度炎癥的作用，更是為脂肪干細(xì)胞

13、提供了干細(xì)胞巢(Niche)[4，9]，首先保證了脂肪干細(xì)胞移植后不被迅速攝取破壞，另外存在于固有細(xì)胞巢中的脂肪干細(xì)胞的異常分化可能大大減少，并且提供了干細(xì)胞攀附的支架，防止了其異位遷徙。所以我們認(rèn)為微?；?xì)胞脂肪基質(zhì)的產(chǎn)品，不僅包含了脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)功能，更是因?yàn)槠浠|(zhì)成分的存在而保護(hù)了干細(xì)胞，同常見的干細(xì)胞懸液直接注射的方式相比，提高了細(xì)胞移植的效率及安全性，更適用于前述慢性軟組織損傷的修復(fù)再生。
　　據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)最

14、新發(fā)布《糖尿病地圖》顯示，我國(guó)有1.14億糖尿病患者，而其中15％會(huì)在病程中出現(xiàn)糖尿病潰瘍。采用臨床常規(guī)療法，如各種生物敷料等，常常需要長(zhǎng)期換藥護(hù)理，由于局部皮膚卻學(xué)狀況無改善，故效果不甚理想。而相關(guān)間充質(zhì)/脂肪來源干細(xì)胞臨床試驗(yàn)則為患者帶來明顯受益[10，11]。對(duì)于干細(xì)胞療法應(yīng)用慢性創(chuàng)面治療有著巨大市場(chǎng)，不同類型規(guī)模的醫(yī)療機(jī)構(gòu)加入其中導(dǎo)致臨床研究和治療領(lǐng)域常常不能滿足《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》，即GMP要求。而微?；?xì)胞脂肪基質(zhì)具有

15、制備簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，相信經(jīng)過制備方法的改善，可在手術(shù)臺(tái)上完成并于同一操作中進(jìn)行治療。而該濃縮干細(xì)胞產(chǎn)物，由于只經(jīng)過了“最低限度處理”，而規(guī)避了干細(xì)胞療法的許多潛在風(fēng)險(xiǎn)，無需審批手續(xù)，而便于臨床推廣應(yīng)用。
　　結(jié)論：
　　微?；?xì)胞脂肪基質(zhì)是自體/異體來源的、由生物活性細(xì)胞外基質(zhì)和活細(xì)胞構(gòu)成的、可注射（100-400μm顆粒）的脂肪處理產(chǎn)物。其制作方法符合法規(guī)對(duì)于臨床醫(yī)生可處理并行組織/細(xì)胞移植的要求。本課題中，我們測(cè)試了微?；?/p>