Pluronic F127水凝膠負(fù)載脂肪干細(xì)胞對糖尿病性潰瘍血管生成及愈合作用的研究.pdf

1、目的:糖尿病難愈性潰瘍是糖尿病患者最嚴(yán)重、治療費(fèi)用最高的慢性并發(fā)癥之一。相較于正常創(chuàng)面，糖尿病性潰瘍往往遷延不愈，其最具特征性的變化是血管發(fā)生受損和肉芽組織形成障礙。目前臨床及動物實(shí)驗(yàn)均顯示干細(xì)胞療法可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合，然而，干細(xì)胞移植到糖尿病難愈性創(chuàng)面面臨著易被原位清除、移植效率低等難題。如何將干細(xì)胞遞送到糖尿病傷口部位同時保持干細(xì)胞的高存活率是干細(xì)胞移植治療糖尿病性潰瘍的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。研究表明，采用新型智能水凝膠作為三維支架理化模擬細(xì)

2、胞外基質(zhì)，為干細(xì)胞移植到宿主創(chuàng)面提供合適的載體是這一問題一種有效的解決途徑。Pluronic F127為聚氧乙烯聚丙乙烯三嵌段聚合物，其水凝膠溶液具有獨(dú)特的溫敏特性，在一定濃度和溫度下可由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗫兹S結(jié)構(gòu)的凝膠態(tài)。因其具有醫(yī)用可注射性及良好的生物相容性，已被美國FDA批準(zhǔn)用于人體。本實(shí)驗(yàn)以糖尿病大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，選取Pluronic F127水凝膠負(fù)載脂肪源性干細(xì)胞創(chuàng)新性應(yīng)于糖尿病創(chuàng)面復(fù)雜的修復(fù)環(huán)境，觀察其對大鼠皮膚創(chuàng)面新生血管形成

3、和愈合作用的影響。
　　方法:第1部分:膠原酶消化法分離培養(yǎng)健康SD大鼠ADSCs并流式鑒定細(xì)胞表型。建立SD大鼠1型糖尿病模型，MTT法比較糖尿病大鼠和正常大鼠ADSCs的增殖能力以選擇合適的干細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第2部分，制備Pluronic F127水凝膠并測定凝膠化時間，CCK-8法檢測不同濃度Pluronic F127對ADSCs增殖的影響，選擇細(xì)胞親和性最佳的凝膠濃度包裹ADSCs制備Pluronic F127-ADSC

4、s復(fù)合物。在成模的24只糖尿病大鼠背部對稱制作2個直徑9mm的全層皮膚切口并隨機(jī)分為ADSCs/Gel組、ADSCs組、Gel組、PBS對照組4組(n=6)。分別注射100ul相應(yīng)溶液于創(chuàng)面。術(shù)后觀察創(chuàng)面大體情況并評估各組創(chuàng)面愈合率，HE染色觀察肉芽組織形成情況，CD31免疫組化染色觀察新生血管情況，Ki67檢測組織細(xì)胞增殖，qPCR檢測VEGF、TGFβ-1的表達(dá)。
　　結(jié)果:成功分離純化并流式鑒定ADSCs，MTT結(jié)果顯示正常

5、ADSCs較糖尿病來源ADSCs增殖能力更好。CCK-8結(jié)果顯示20％的Pluronic F127相較于其他組更適宜細(xì)胞生長。動物傷口大體觀和HE染色顯示ADSCs/Gel組愈合較快且組織學(xué)評分較佳，在術(shù)后14天時愈合率為（97.8±1.8）％，明顯高于其他組(P=0.000)。免疫組化結(jié)果示術(shù)后7天ADSCs/Gel、ADSCs組的血管數(shù)直觀較Gel、對照組豐富，對術(shù)后14天進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)ADSCs/Gel組微脈管數(shù)目為(21.0±2

6、.4)個，明顯高于ADSCs組的（15.7±1.4）個(P=0.000)。qPCR結(jié)果也顯示實(shí)驗(yàn)組VEGF、TGFβ-1水平在術(shù)后7、14天時出現(xiàn)了相應(yīng)上調(diào)(P＜0.05)。免疫熒光結(jié)果示ADSCs/Gel組在術(shù)后7天時Ki67陽性表達(dá)率多于其他三組。
　　結(jié)論:局部移植同種異體ADSCs通過Pluronic F127水凝膠的包裹能提高細(xì)胞移植到糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的效率，從而優(yōu)化了ADSCs促進(jìn)糖尿病性潰瘍血管生成和創(chuàng)面愈合的作用。