綿羊equatorin（赤道素）的cDNA克隆、原核表達(dá)、抗體制備及在頂體反應(yīng)前后精子上的定位.pdf

1、哺乳動(dòng)物的成功受精是動(dòng)物的種族延續(xù)和基因進(jìn)化的前提，精子與卵子的質(zhì)膜粘附并融合是哺乳動(dòng)物完成受精所必需的步驟。近年來，在很多學(xué)者利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段對精卵質(zhì)膜粘附和融合過程進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，精卵融合是一個(gè)多分子多受體的協(xié)調(diào)下共同參與發(fā)生的過程。現(xiàn)階段普遍認(rèn)為精卵融合的起始部位為精子膜赤道區(qū)，而對equatorin的研究起始于應(yīng)用MN9單克隆抗體對精子上該蛋白的識(shí)別，而且體外注射MN9抗體能顯著抑制精卵融合，初步猜想Eqtn為精卵融合相

2、關(guān)蛋白。但是Eqtn究竟以何種方式參與頂體并最終介導(dǎo)精卵融合尚未知。
　　本實(shí)驗(yàn)以內(nèi)蒙古綿羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，首先根據(jù)GenBank中已公布的相關(guān)物種Eqtn基因序列信息，對比其CDs區(qū)尋找保守序列，設(shè)計(jì)該基因的特異性引物。提取綿羊睪丸組織總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板克隆Eqtn基因的cDNA，并測序。測序后，根據(jù)該cDNA的可參考序列，設(shè)計(jì)特異性引物克隆去掉信號(hào)肽后的基因片段(19aa-336aa)。將克隆得到的cDN

3、A片段插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Eqtn;將重組質(zhì)粒PGEX-Eqtn轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在最優(yōu)的表達(dá)條件下，37℃，大量表達(dá)Eqtn蛋白4h;利用還原性谷光甘肽親和純化柱子過濾菌體表達(dá)產(chǎn)物的上清液，獲得純化的融合蛋白GST-Eqtn。將獲得的Eqtn純化蛋白濃縮后，與弗氏佐劑等量混合制成抗原乳劑，皮下多點(diǎn)注射昆明雄性小鼠，每10天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。35天后注射S180腹水

4、瘤細(xì)胞。當(dāng)免疫小鼠的腹部明顯鼓起后，收集腹水與血清中的多克隆抗體，利用間接Elasa法檢測了抗體的效價(jià)。根據(jù)抗原與抗體的特異性的免疫反應(yīng)，通過Western Bloting檢測了該抗體對純抗原蛋白GST-Eqtn以及綿羊睪丸組織蛋白的免疫特異性。經(jīng)過檢測合格的自制抗體即可用于之后的免疫組織化學(xué)檢測。最后用自制的多克隆抗體分別對綿羊睪丸組織切片和頂體反應(yīng)前后綿羊的精子細(xì)胞切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，通過顯色反應(yīng)識(shí)別抗體anti-Eqtn與相