慢病毒介導YAP基因過表達促miPSC-ECs增殖的實驗研究.pdf

1、本文對慢病毒介導YAP基因過表達促miPSC-ECs增殖進行了實驗研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：miPSC-ECs的建立及YAP基因重組慢病毒載體pPGK-2Flag-YAP2-Puro的構建。
　　目的：建立小鼠誘導性多能干細胞來源的內皮細胞（Mouse induced pluripotent stem cells-Endothelial cells,miPSC-ECs）；構建Yes相關蛋白（Yes-assoc

2、iated protein,YAP）重組慢病毒表達質粒并行慢病毒包裝。
　　方法：誘導miPSCs分化為ECs(miPSC-ECs)；對miPSC-ECs進行細胞學鑒定及形態(tài)學觀察。從模板質粒（pCMV-Flag-YAP2-5SA）中獲取目的基因YAP2并擴增，將其cDNA亞克隆至穿梭質粒pPGK-iRFP-IRES-Puro，構建重組慢病毒表達質粒（pPGK-2Flag-YAP2-Puro）；將pPGK-2Flag-YAP2-P

3、uro和輔助包裝元件共轉染293FT細胞行慢病毒包裝。
　　結果：miPSCs誘導分化所得細胞第3天形態(tài)呈條索狀、扁平、梭形，兩端有突起，符合 ECs形態(tài)學特征；細胞免疫熒光染色后miPSCs誘導分化所得細胞表達 CD31。重組慢病毒表達質粒（pPGK-2Flag-YAP2-Puro）構建成功，YAP基因過表達慢病毒包裝成功，滴度達到1.2×109TU/ml。
　　結論：成功獲得miPSC-ECs；成功構建YAP基因慢病毒過

4、表達載體。
　　第二部分：慢病毒介導YAP基因體外感染miPSC-ECs及其促增殖的實驗研究。
　　目的：將構建好的YAP基因慢病毒過表達載體感染miPSC-ECs，建立過表達YAP基因的細胞株miPSC-ECs/YAP；研究過表達YAP基因對miPSC-ECs內磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（Phoshoinositide-3-kinase/Protein Kinase B，PI3K/Akt）信號通路的活化作用，以及對mi

5、PSC-ECs增殖的影響。
　　方法：慢病毒包裝重組慢病毒表達質粒（pPGK-2Flag-YAP2-Puro），并感染miPSC-ECs。嘌呤霉素（Puromycin）篩選穩(wěn)定感染的細胞miPSC-ECs/YAP，并用RT-PCR及Western blot方法驗證。MTT比色法檢測過表達YAP對miPSC-ECs增殖的影響。Western blot方法檢測轉染YAP后miPSC-ECs內PI3K/Akt信號通路相關蛋白PTEN、P

6、-Akt以及Pan-Akt的表達。
　　結果：轉染YAP的miPSC-ECs中YAP mRNA表達水平較未轉染細胞明顯升高，YAP蛋白高表達（未轉染細胞中YAP蛋白幾乎不表達）。轉染YAP的miPSC-ECs較未轉染YAP的miPSC-ECs增殖速度明顯加快。同步化之后24小時（0.113±0.004 vs0.077±0.004，P<0.01）、48小時（0.368±0.010 vs0.199±0.006，P<0.01）、72小時

7、（0.716±0.004vs0.418±0.018，P<0.01），miPSC-ECs/YAP組MTT光密度值(OD值)較未轉染組顯著增加。miPSC-ECs/YAP組較未轉染組人第10號染色體缺失的磷酸酶(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)/GAPDH比值明顯降低（0.63±0.02 vs0.88±0.03，P<0.05），磷酸化AKT(Phos