調(diào)節(jié)性T細胞在母胎耐受中的作用機制及對H-Y皮膚移植影響的研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：探討妊娠濃度雌、孕激素對小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞的影響及可能機制。
　　 方法：實驗分為體內(nèi)部分和體外部分。體內(nèi)實驗：建立去勢C57BL/6小鼠模型，兩周后分別予以皮下注射雌激素（E2）、孕激素（P4）、雌孕激素聯(lián)合及溶劑（生理鹽水）模擬重建妊娠濃度小鼠激素水平。維持兩周后，流式細胞術和免疫組化檢測給藥后小鼠外周血、脾臟、腹腔淋巴結、胸腺中調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）比例變化情況。并通過ELISA的方法檢

2、測外周血中TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-10、TGF-β等細胞因子水平的變化。體外實驗：通過CFSE標記磁珠分選的調(diào)節(jié)性T細胞反應細胞，外加E2和共刺激信號，觀察標記的調(diào)節(jié)性T細胞是否發(fā)生增殖，并進一步通過CFSE標記法結合單向混合淋巴細胞培養(yǎng)來驗證其調(diào)節(jié)性T細胞的功能。
　　 結果：體內(nèi)實驗：無論雌、雄小鼠，去勢后單獨的妊娠水平的E2即可明顯提高外周血、脾臟、腹腔淋巴結中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4

3、+T細胞的比例(分別為6.13±1.32％；10.50±1.85％；7.63±1.68％)，與溶劑組相比有明顯統(tǒng)計學差異（P<0.05）。但在胸腺中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例與溶劑組沒有統(tǒng)計學差異。與此同時，單獨的妊娠水平的P4相比于溶劑組，Treg比例有所升高，但不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而聯(lián)合應用雌、孕激素對Treg的影響與單獨應用E2的結果類似，兩者沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。相同干預藥物，Treg的

4、比例變化在雌雄兩組之間沒有差異（P＞0.05）。同樣的結果在免疫組化中得到驗證。對于外周血中細胞因子的影響，在沒有外來抗原刺激的條件下是沒有多大影響的。
　　 體外實驗：單獨的E2處理對于調(diào)節(jié)性T細胞并不能直接誘導CFSE標記的調(diào)節(jié)性T細胞的增殖（PI=1.01±0.01），單獨的TCR雙信號刺激也不能檢測到CFSE的增殖（PI=1.03±0.02），只有在E2的預處理聯(lián)合CD3/CD28的刺激下才能檢測到調(diào)節(jié)性T細胞自身的增殖

5、（PI=1.15±0.03）。驗證了E2對于調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量上的促增殖作用之后，功能學方面的實驗結果提示，CD3/CD28的刺激能顯著促進CD4+CD25-Na?ve T細胞的增殖（PI=1.56±0.03），在此基礎上按照反應細胞與調(diào)節(jié)性T細胞比為1:1，未經(jīng)E2處理組也能檢測到對刺激后增殖的抑制（PI=1.18±0.04），E2的預處理能進一步增強調(diào)節(jié)性T細胞的抑制功能（PI=1.07±0.02），不僅與刺激組相比有差異（1.07±

6、0.02vs1.56±0.03，P<0.05），與未經(jīng)E2處理組同樣有差異（1.07±0.02vs1.18±0.04，P<0.05）。證明了E2不僅能通過促進調(diào)節(jié)性T細胞的增殖而擴增，而且在功能上也能進一步增強其對效應T細胞活化后增殖的抑制效應。
　　 結論：單獨應用妊娠濃度E2可明顯提高小鼠外周血，脾臟，腹腔淋巴結CD4+CD25+Foxp3+Treg比例，妊娠濃度的P4對外周Treg沒有影響，兩種激素對中樞淋巴器官的淋巴細胞

7、均沒有影響。這可能與小鼠T淋巴細胞中雌、孕激素的受體分布、功能及與性別遺傳沒有相關性有關。體外實驗的結果不僅驗證妊娠水平的E2通過改變調(diào)節(jié)性T細胞的無反應性，在聯(lián)合TCR信號下能促進調(diào)節(jié)性T細胞自身發(fā)生增殖，還能在功能上加強調(diào)節(jié)性T細胞的抑制作用。無論是中樞還是外周的調(diào)節(jié)性T細胞的比例均沒有影響。妊娠水平的雌、孕激素對于血清中細胞因子免疫網(wǎng)絡是沒有太大的影響。
　　 第二部分：
　　 目的：探討妊娠中調(diào)節(jié)性T細胞的免疫調(diào)

8、節(jié)作用是否具有抗原特異性。
　　 方法：本實驗分體外部分和體內(nèi)部分。體外實驗：以雌性CBA/J與雄性DBA/2J同籠構建流產(chǎn)趨勢模型，從流產(chǎn)趨勢孕10天雌鼠脾臟分離的單個核細胞經(jīng)尼龍毛處理后作為效應T細胞（Tef）；DBA雄鼠脾細胞經(jīng)MMC處理后作為APC；根據(jù)培養(yǎng)體系中調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的來源分組：未孕CBA雌鼠來源的Treg為未孕組，正常妊娠（CBA/J×Balb/c）來源的Treg為正常妊娠組，無關正常妊娠（Balb

9、/c×C57BL/6）來源的Treg為正常妊娠無關對照組。按照Tef與Treg比分別為10:1，1:1，1:5構建單向混合淋巴細胞培養(yǎng)體系，72小時后，流式細胞儀檢測標記細胞的增殖指數(shù)（Proliferative Index，PI），ELISA檢測細胞因子水平。
　　 體內(nèi)實驗：構建流產(chǎn)趨勢的妊娠模型，于妊娠第0-2天，過繼輸注來自正常妊娠組、未孕組、無關妊娠對照組的CD4+CD25+Treg，觀察Treg的過繼輸注對妊娠結局的

10、影響。按照Treg的來源不同分為：正常妊娠組、未孕組、無關妊娠對照組。
　　 結果：體外實驗：在Tef與Treg比例為10:1的體系中，未孕組效應性T細胞增殖明顯受到抑制。在1:1，1:5的體系中同樣均能檢測到明顯的抑制效應，但這種抑制效應沒有劑量依賴性。而分別來自于其他兩組正常妊娠小鼠的Treg也表現(xiàn)出相似的增殖抑制效應，各組之間沒有統(tǒng)計學差異。在Treg的干預后培養(yǎng)體系中細胞因子水平的變化在Treg的干預后，IL-10的水平

11、明顯升高，并且這種水平的升高呈Treg劑量依賴性正相關。而IFN-γ的水平明顯減少，并且與Treg劑量呈負相關。
　　 體內(nèi)實驗：在外周血中，流產(chǎn)趨勢組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+T細胞的比例較未孕組明顯增高（6.59％vs3.55％，P<0.05）；正常妊娠組中外周血能檢測到更為顯著的Treg的升高，不僅與未孕組有差異（8.34％vs3.55％，P<0.05），與流產(chǎn)趨勢組亦有明顯差異（8.34％vs6

12、.59％，P<0.05）。同樣，在淋巴結（6.86％vs4.85；9.62％vs4.85％，P<0.05；9.62％vs6.86％，P<0.05）中也獲得相似結果。過繼輸注后，只有來自正常妊娠組小鼠的Treg的過繼輸注才能完全阻止流產(chǎn)的發(fā)生。而來自未孕組和無關對照組的Treg不能逆轉流產(chǎn)的發(fā)生。Treg過繼輸注不能改變體內(nèi)Th1型細胞因子水平，但是能顯著提升IL-10水平。
　　 結論：無論哪種來源的Treg都具有免疫調(diào)節(jié)的潛能

13、。在體外均能檢測到對Treg增殖的抑制效應，但并沒有表現(xiàn)出抗原特異性的更為顯著抑制功能；Treg在體外可能是通過分泌高濃度的IL-10發(fā)揮抑制效應。但在體內(nèi)正常的妊娠過程中產(chǎn)生的Treg在保護胚胎免受母體攻擊方面是具有抗原特異性的，只有之前接觸胎兒父系抗原的具有抗原特異性的Treg才能在體內(nèi)發(fā)揮對胎兒的保護作用。
　　 第三部分：
　　 目的：探討妊娠濃度雌激素(E2)、孕激素(P4)對小鼠H-Y皮膚移植的影響及其機制。

14、方法：建立小鼠去勢模型，每日分別注射E2、P4及E2+P4聯(lián)合注射，14d后受鼠行H-Y皮膚移植并繼續(xù)給藥。檢測移植前及移植后第3天外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）變化及外周血細胞因子水平；觀察H-Y皮膚移植物的存活。
　　 結果：E2可提高外周血Treg的比例（6.13±1.32％vs3.26±0.68％，P<0.05），移植后Treg的比例進一步升高（11.78±2.32％vs3.33±0.57

15、％，P<0.05）；P4對Treg沒有顯著影響（4.01±0.79％vs3.26±0.68％，P>0.05），而移植前后E2+P4聯(lián)合對Treg的影響與單獨應用E2結果相似（6.13±1.32％vs7.25±1.71％，P>0.05；12.35±3.04％vs11.78±2.32％，P>0.05）。移植后P4對Treg仍無明顯影響，而E2+P4聯(lián)合亦不能進一步提高Treg的比例。細胞因子檢測顯示，E2、P4均能減少促炎因子分泌，并提高抗