高脂及炎癥狀態(tài)激活mTOR信號通路導(dǎo)致肝臟CD36翻譯效率升高.pdf

1、目的:非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)已經(jīng)成為危害人類健康的主要代謝性疾病之一，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。高脂及炎癥狀態(tài)均可以作為獨(dú)立的危險因素導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生發(fā)展。CD36屬于B族清道夫受體，可以介導(dǎo)長鏈脂肪酸及氧化低密度脂蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，其表達(dá)量與肝臟脂肪變性程度密切相關(guān)。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR

2、)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖及蛋白質(zhì)翻譯中起著重要的作用。本課題旨在研究高脂及炎癥狀態(tài)是否可以通過激活mTOR信號通路導(dǎo)致CD36翻譯效率升高，最終引起CD36蛋白表達(dá)量及肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積增加。
　　方法:使用軟脂酸、TNF-α及IL-6處理人肝癌細(xì)胞株HepG2，高脂飼料喂養(yǎng)及酪蛋白皮下注射C57BL/6J小鼠的方法建立體外及體內(nèi)高脂及炎癥模型。HepG2細(xì)胞分為:對照組1(0.2％ BSA)、軟

3、脂酸處理組(0.2％ BSA+0.08mmol/L軟脂酸)、對照組2(0.2％ BSA+0.04mmol/L軟脂酸)、TNF-α處理組（0.2％ BSA+0.04mmol/L軟脂酸+25ng/mLTNF-α）、IL-6處理組(0.2％ BSA+0.04mmol/L軟脂酸+20ng/mLIL-6)，處理時間為24小時。雄性C57BL/6J小鼠分為:正常飼料組（正常飼料）、高脂飼料組（高脂飼料）、正常飼料+酪蛋白處理組（正常飼料+0.5mL

4、10％酪蛋白皮下注射），建模時間為14周。油紅O染色觀察肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的情況。酶聯(lián)免疫吸附試驗及酶偶聯(lián)比色法分別檢測肝細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸(FFA)及甘油三酯(TG)含量。Real-TimePCR檢測肝細(xì)胞CD36 mRNA表達(dá)。Western Blotting檢測肝細(xì)胞CD36蛋白表達(dá)，mTOR及其下游翻譯調(diào)控蛋白:核糖體蛋白p70S6激酶(p70ribosomal protein S6 kinase，p70S6K)、eIF4E結(jié)合蛋白

5、1（eukaryoticinitiation factor4E-binding protein1，4E-BP1）及真核翻譯起始因子4E(eukaryotic initiation factor4E，eIF4E)的磷酸化水平。蛋白降解實驗檢測肝細(xì)胞CD36蛋白穩(wěn)定性。多聚核糖體分析檢測肝細(xì)胞CD36翻譯效率。并應(yīng)用mTOR特異性抑制劑雷帕霉素作用于高脂及炎癥狀態(tài)下的HepG2細(xì)胞（10ng/mL雷帕霉素）及C57BL/6J小鼠(2mg/k

6、g體重的雷帕霉素皮下注射)，觀察其對上述檢測指標(biāo)的影響。
　　結(jié)果:油紅O染色、FFA及TG定量檢測發(fā)現(xiàn)高脂及炎癥狀態(tài)能使HepG2細(xì)胞及C57BL/6J小鼠肝臟組織脂質(zhì)蓄積增加(P＜0.05)。Western Blotting及Real-Time PCR檢測發(fā)現(xiàn)高脂及炎癥狀態(tài)能使CD36蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），而CD36蛋白表達(dá)量卻沒有明顯變化(P＞0.05)。蛋白降解實驗發(fā)現(xiàn)高脂及炎癥狀態(tài)并沒有改變HepG2細(xì)胞CD3

7、6蛋白穩(wěn)定性(P＞0.05)。多聚核糖體分析發(fā)現(xiàn)高脂及炎癥狀態(tài)可以使CD36翻譯效率明顯升高。進(jìn)一步行Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn)高脂及炎癥狀態(tài)可以升高mTOR及其下游翻譯調(diào)控蛋白p70S6K、4EBP-1及eIF4E的磷酸化水平（P＜0.05）。加入雷帕霉素之后，相應(yīng)的高脂及炎癥處理組mTOR信號通路磷酸化水平降低(P＜0.05)，導(dǎo)致CD36翻譯效率及蛋白表達(dá)量減少(P＜0.05)，最終引起HepG2細(xì)胞及C57BL/6