烏司他丁通過Rho-ROCK信號通路抑制炎癥狀態(tài)下血管內(nèi)皮高通透性的研究.pdf

1、第一部分：烏司他丁對TNF-α作用下EA.hy926細胞通透性的影響及相關機制的研究
　　目的：
　　探討烏司他?。║TI）對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）所致血管內(nèi)皮細胞通透性增加的影響及其主要的分子機制。
　　方法：
　　以TNF-α干預人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EA.hy926，建立炎癥刺激的細胞模型，用 UTI干預 EA.hy926細胞，構建RhoA過表達慢病毒，采用Transwell法、TEER法檢測細胞通透性

2、；免疫熒光法測肌球蛋白磷酸酶結合亞基1（p-MYPT1）的表達及細胞纖維肌動蛋白（F-actin）形態(tài)及分布；分別采用免疫細胞化學法、Western Blot法及qRT-PCR法檢測與通透性相關的關鍵分子RhoA、Rho關聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶Ⅱ(ROCK2)、MYPT1、p-MYPT1及內(nèi)皮血管鈣黏蛋白（VE-cadherin）表達的變化情況。
　　結果：
　　1.TNF-α作用下EA．hy926單層細胞電阻值明顯降低，細胞

3、通透性顯著升高（P＜0.05），細胞內(nèi) p-MYPT1的表達量較正常組明顯增加，F(xiàn)-actin細胞骨架明顯重新分布，細胞內(nèi)應力纖維增多，VE-cadherin的表達量明顯降低，而UTI可改善EA．hy926的上述變化情況；
　　2.免疫細胞化學及Western Blot結果均顯示，與正常對照組比較，TNF-α使RhoA、ROCK2的表達明顯增加（均P＜0.05），而UTI可抑制這兩種蛋白的高表達；
　　3.與未轉染病毒細胞相

4、比，UTI和TNF-α作用下，RhoA過表達使細胞內(nèi)RhoA、ROCK2及p-MYPT1的表達顯著增高，VE-cadherin表達降低，細胞通透性增加（均P＜0.05）；而空載對照病毒對RhoA、ROCK2、p-MYPT1和VE-cadherin的表達以及細胞通透性無明顯影響（均P＞0.05）。
　　結論：
　　UTI以劑量依賴性方式抑制TNF-α引起的EA.hy926細胞通透性增加，這一作用可能與Rho/ROCK信號通路有

5、關。
　　第二部分：烏司他丁對脂多糖誘導膿毒癥小鼠肺損傷的保護作用及其可能機制
　　目的：
　　探討烏司他?。║TI）對脂多糖（LPS）誘導膿毒癥小鼠肺損傷的保護作用及其可能機制。
　　方法：
　　1.將C57BL/6小鼠隨機分為對照組（Con組，n=10）、模型組（LPS組，n=10）及UTI干預組（L+U組，n=30），建立LPS膿毒癥小鼠模型；
　　2.采用肺組織肺濕干重比（W/D）法及伊文思藍

6、染色（Evans Blue，EB）法觀察各組小鼠肺組織含水量及肺微血管通透性的變化；
　　3.HE染色法檢測各組小鼠肺組織病理變化；
　　4.免疫組化法檢測肺組織VE-cadherin及ROCK2表達水平的變化。
　　結果：
　　1.與對照組比較，LPS組小鼠肺組織W/D及EB含量均顯著增加（均P＜0.05），而UTI干預組W/D及EB含量明顯降低，其中UTI在104 U/kg、105 U/kg劑量時，與LPS組

7、相比，有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）；
　　2.與對照組小鼠肺組織相比，LPS組小鼠肺組織水腫，損傷嚴重，而UTI干預組肺組織損傷明顯減輕；
　　3.免疫組化結果顯示，LPS組小鼠肺組織VE-cadherin的表達明顯降低，ROCK2的表達明顯增高（均P＜0.05），而UTI干預后，VE-cadherin的表達顯著增加，ROCK2的表達顯著下降（均P＜0.05）。
　　結論：
　　UTI以一定的劑量依賴性降低LP