禽致病性大腸桿菌信號分子AI-2受體檢測方法建立及其靶蛋白鑒定.pdf

1、禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）可感染雞、鴨、火雞和其他禽類，使宿主出現(xiàn)氣囊炎、蜂窩組織炎、輸卵管炎、腹膜炎等癥狀，是養(yǎng)禽業(yè)最常見的致病菌之一。
　　LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陽性和陰性細菌中，可產(chǎn)生種間通用信號分子 AI-2，并調(diào)控細菌的多種生理功能。AI-2信號由胞外轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)需要借助于細胞的AI-2受體，目前哈維氏弧菌的LuxP型受體和鼠傷

2、寒沙門的LsrB型受體已被證實存在多種細菌中。但關(guān)于APEC的AI-2受體，目前尚缺乏相關(guān)報道。
　　本研究旨在通過建立APEC的AI-2受體檢測方法，運用蛋白組學技術(shù)，篩選AI-2調(diào)控的靶蛋白，為進一步探究LuxS/AI-2型密度感應(yīng)系統(tǒng)在APEC中的調(diào)控通路及鑒定AI-2受體提供參考，從而為從細菌群體角度防治APEC提供新的思路。
　　1.AI-2受體蛋白檢測的方法建立
　　為了建立AI-2受體檢測方法，本研究首先

3、通過基因缺失的方法，構(gòu)建大腸桿菌BL21(DE3)的luxS基因缺失株，成功獲得不能產(chǎn)生AI-2的BL21(DE3)缺失株，并命名為BL21(DE3)?luxS。
　　運用pColdTF質(zhì)粒構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌LsrB蛋白的原核表達載體pColdTF-lsrB，并分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)?luxS和BL21(DE3)中，經(jīng)體外誘導表達，成功獲得具有生物學活性的LsrB蛋白。
　　運用純化的LsrB對AI-2分子進行了結(jié)合

4、與釋放實驗。實驗結(jié)果表明LsrB對AI-2分子具有結(jié)合能力，且結(jié)合能力是建立在LsrB的活性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上；活性結(jié)構(gòu)喪失后的LsrB不能夠結(jié)合AI-2，并釋放已結(jié)合AI-2。通過建立AI-2受體的檢測方法，為進一步開展APEC的AI-2受體篩選奠定基礎(chǔ)。
　　2.運用蛋白組學技術(shù)篩選APEC中AI-2的靶蛋白
　　對APEC內(nèi)化外源性AI-2的動力學研究表明，加入AI-2后第3 h時，APEC對AI-2內(nèi)化效率最高（72％）。但

5、運用熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)，對APEC內(nèi)化外源性AI-2后luxS、pfs、iss和tsh的轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果表明，AI-2內(nèi)化5h時，上述基因轉(zhuǎn)錄水平變化最顯著（p＜0.001）。上述研究結(jié)果表明從APEC對AI-2的內(nèi)化和AI-2對APEC的基因調(diào)控是不同步的。
　　為了研究AI-2對APEC的靶蛋白的調(diào)控作用，本研究結(jié)合APEC內(nèi)化外源性AI-2的內(nèi)化動力學結(jié)果，選擇AI-2加入APEC中5 h時的菌體，運用非標記定量

6、蛋白組學方法檢測受AI-2調(diào)控靶蛋白，同時設(shè)立不加AI-2的APEC對照組，比較兩者蛋白表達差異，篩選APEC中受AI-2調(diào)控的靶蛋白。非標記定量蛋白質(zhì)組學結(jié)果顯示共檢測到受AI-2調(diào)控的顯著性差異蛋白質(zhì)479個，對差異蛋白的生物信息分析結(jié)果表明，受AI-2調(diào)控的靶蛋白主要參與APEC的代謝和信號轉(zhuǎn)導過程。
　　3.AI-2靶基因缺失株的構(gòu)建及生物學特性分析
　　對運用蛋白組學技術(shù)篩選到的AI-2靶蛋白進行分析，選取5個受A

7、I-2調(diào)控的靶蛋白基因（3630、tufB、phoH、kgtP和yjaE），運用Red同源重組的方法，成功獲得上述基因的缺失株。
　　對構(gòu)建的缺失株進行AI-2內(nèi)化檢測，結(jié)果表明，與野生株相比，上述基因的缺失，并不能顯著影響AI-2的內(nèi)化。本文推測選取的5個AI-2靶基因，不是APEC的AI-2受體基因，不參與APEC對AI-2的內(nèi)化。
　　對缺失株的LD50檢測結(jié)果表明，缺失株對櫻桃谷鴨的致病能力未呈現(xiàn)明顯變化（出現(xiàn)10倍