乙型肝炎病毒HBx蛋白的表達(dá)純化及全基因組蛋白與宿主蛋白之間相互作用組模型的建立.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生的主要原因之一,而HBV相關(guān)的HCC排名十大癌癥之一。在目前,全世界HBV慢性感染患者有兩億人,因此,HBV對人類的健康仍然是嚴(yán)重的威脅。盡管HBV相關(guān)肝癌的致病機(jī)理仍然不清楚,但有證據(jù)表明,HBx蛋白在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中有重要的作用。HBx蛋白是一種多功能的調(diào)節(jié)因子,它直接或間接地通過與宿主蛋白的相互作用參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、蛋白降解、細(xì)胞凋亡和遺傳穩(wěn)定。<

2、br>　　 HBV的HBx基因編碼154個氨基酸,大小為17KD。這些氨基酸殘基中的九個半胱氨酸殘基對HBx蛋白的結(jié)構(gòu)具有十分重要的作用,前八個半胱氨酸殘基形成四對二硫鍵,分別是Cys7和Cys78,Cys17和Cys115,Cys61和Cys137,Cys69和Cys143,而Cys148是游離的。每個半胱氨酸殘基與其后面的第四個半胱氨酸殘基形成二硫鍵而最后一個半胱氨酸殘基又是游離的,這樣的特殊結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致復(fù)性后HBx蛋白在溶液中

3、存在多態(tài)性的原因。在用大腸桿菌表達(dá)完整的HBx蛋白或截斷的HBx蛋白時,得到的目的蛋白總是以包涵體的形式存在,后期純化還需要變性和復(fù)性,這對HBx蛋白的天然結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響。但是在使用大腸桿菌表達(dá)出來的經(jīng)過變性復(fù)性的HBx蛋白做功能試驗時,它仍然具有與RNA和人的P53蛋白結(jié)合的活性。這說明了大腸桿菌表達(dá)出來的HBx蛋白在一級結(jié)構(gòu)上是完全正確的并具有HBx蛋白在細(xì)胞中的一些功能。在用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HBx蛋白時,它在昆蟲細(xì)胞

4、中有兩種存在狀態(tài),一種是微量的可溶性狀態(tài),一種是大量的聚集狀態(tài)。在后期的表達(dá)純化時,也涉及到了變性和復(fù)性,而在使用核磁共振驗證HBx蛋白的二硫鍵是否正確折疊時,發(fā)現(xiàn)復(fù)性的HBx蛋白只有三對二硫鍵。因此,不論是用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)還是用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),存在的主要問題就是要能大規(guī)模表達(dá)出正確折疊的可溶性的HBx蛋白。
　　 為了能表達(dá)出可溶性的HBx蛋白,選擇合適的表達(dá)質(zhì)粒和宿主菌是成功的關(guān)鍵。在大腸桿菌和桿狀病毒系統(tǒng)中使用GS

5、T和His標(biāo)簽融合到HBx的N端,表達(dá)出來的融合蛋白均是包涵體。我們選擇了pET32a、pQE30和pMAL-c2x質(zhì)粒作為表達(dá)質(zhì)粒,其中在pMAL-c2x質(zhì)粒上攜帶了麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)簽,pQE30質(zhì)粒上攜帶了His標(biāo)簽和pET32A質(zhì)粒攜帶了Trx、S和His標(biāo)簽。我們把這些構(gòu)建了HBx基因的表達(dá)質(zhì)粒分別在BL21(DE3)、TB1和JM109菌株中表達(dá),預(yù)實(shí)驗結(jié)果顯示,只有攜帶HBx基因的pMAL-c2x質(zhì)粒在JM109菌

6、株表達(dá)的融合蛋白才是可溶的,而在BL21(DE3)菌株中部分融合蛋白是可溶的,在TB1菌株中不表達(dá)。這說明了MBP標(biāo)簽對HBx蛋白在細(xì)菌中表達(dá)的可溶性有一定的幫助。我們培養(yǎng)了15L的細(xì)菌,收集菌體后超聲破碎,然后通過離心,上親和樹脂柱和離子交換柱,純化出了60mg的融合蛋白。通過Factor Xa蛋白酶酶切,48小時后,發(fā)現(xiàn)溶液中有類似膠體的沉淀。通過分析發(fā)現(xiàn)HBx蛋白的PI為8.6,MBP的PI為4.9,MBP-HBx蛋白的PI為6.

7、1,而溶液的PH為8.0,因此我們通過PH值調(diào)節(jié),發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶液PH值為10.0時,白色膠狀體消失,溶液變澄清。為了能增加蛋白的可溶性,我們在透析酶切產(chǎn)物時加入了1M Urea和0.05％SDS,然后再通過凝膠柱來分離這三個蛋白。通過凝膠柱分離后,目的蛋白HBx的濃度為0.5mg/ml。這為研究HBx蛋白的結(jié)構(gòu)奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 HBV感染在全世界是肝臟癌癥發(fā)生的最普通的原因,它主要通過體液傳播、性傳播和母嬰傳播。HBV是一種

8、雙鏈DNA病毒,屬于肝DNA病毒屬,能引起急性和慢性肝炎。HBV基因組由全長為3.2kb的正鏈與一條不完全的負(fù)鏈組成不完全閉合的雙鏈環(huán)狀DNA,編碼四條重疊的mRNA分子,大小分別為3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb,然后在細(xì)胞質(zhì)中編碼七種病毒蛋白,分別是多聚酶(P)、S抗原、preS1、preS2、C抗原、preC、e抗原。其中3.5kb的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物翻譯形成多聚酶、核心蛋白(C)和前核心蛋白(preC),并作為前基因組的RN

9、A模板,反轉(zhuǎn)錄后作為病毒基因組復(fù)制的第一步。2.4kb和2.1kb轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生大、中、小三個包裝蛋白,分別為preS1、preS2、S抗原。這三種蛋白具有一個共同的C端,只是在N端的氨基酸序列延長的長短不同。0.7kb的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生X蛋白,它具有轉(zhuǎn)錄激活的功能。
　　 HBV在感染、復(fù)制和增殖期間通過病毒蛋白與宿主蛋白相互作用不斷的適應(yīng)和調(diào)節(jié)宿主的環(huán)境,達(dá)到在宿主細(xì)胞生存的目的。通過研究病毒蛋白與宿主蛋白相互作用的數(shù)據(jù),我們可以

10、全面分析病毒的生命周期,同時有可能發(fā)現(xiàn)一些重要的相互作用,為將來的藥物治療提供一個新的靶標(biāo)?；谶@個目的,我們利用TAP標(biāo)簽技術(shù)來研究HBV基因組蛋白與肝細(xì)胞HepG2蛋白的相互作用。首先,我們構(gòu)建了HBV基因組質(zhì)粒pCR-XL-TOPO-HBV,然后以此為模板,分別擴(kuò)增了P、S、preS1、preS2、C、preC和e基因。其次,我們構(gòu)建了在C端攜帶TAP標(biāo)簽和N端攜帶生物素標(biāo)簽的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBT-TAP-IRES-BIRA,并以

11、此載體作為對照載體。最后,我們把擴(kuò)增的七個基因分別插入到pBT-TAP-IRES-BIRA質(zhì)粒的SnaB I位點(diǎn),構(gòu)建了pBTIB-P、pBTIB-S、pBTIB-C、pBTIB-X、pBTIB-preC、pBTIB-preS1、pBTIB-preS2。為了減少標(biāo)簽蛋白對靶蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響,我們在SnaB I位點(diǎn)兩邊加上了柔性氨基酸序列GSGGSG。
　　 我們通過把pBT-TAP-IRES-BIRA、pBTIB-X、pBT

12、IB-P、pBTIB-S、pBTIB-C、pBTIB-preC、pBTIB-preS1、pBTIB-preS2轉(zhuǎn)入PT67細(xì)胞包裝病毒來感染HepG2,用3.5μg/ml嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株,然后通過PT67細(xì)胞包裝病毒感染HepG2細(xì)胞,用50μg/ml的勻霉素和1μg/ml的嘌呤霉素篩選并獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。然后我們用TAP標(biāo)簽的抗體通過Westernblotting來鑒定目的蛋白的表達(dá)。最后,我們獲得了分別穩(wěn)定表達(dá)P、S、pr