惡性瘧原蟲野生株致病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、瘧疾目前仍然嚴(yán)重危害人類的健康，全球每年死于瘧疾的人數(shù)超過一百萬(wàn)。在感染人體的四種瘧原蟲中，惡性瘧原蟲感染可引起重癥瘧疾，包括腦型瘧和妊娠相關(guān)性瘧疾。導(dǎo)致重癥瘧疾的病理基礎(chǔ)是惡性瘧原蟲感染的紅細(xì)胞(iRBC)粘附血管內(nèi)皮細(xì)胞繼而堵塞腦部毛細(xì)血管或黏附在子宮毛細(xì)血管部位。研究已經(jīng)表明，這種黏附作用主要是由一種被稱為惡性瘧原蟲紅細(xì)胞膜蛋白1(PfEMP1)的分子介導(dǎo)的，該分子能與宿主體內(nèi)20多種受體分子結(jié)合，是惡性瘧原蟲關(guān)鍵的致病因子。

2、r>　　 PfEMP1蛋白是由惡性瘧原蟲var基因家族編碼的產(chǎn)物，該基因系變異基因家族，在惡性瘧原蟲3D7株基因組中含有約60個(gè)var基因，分布在不同染色體的亞端?；蛑虚g位置上。Var基因的結(jié)構(gòu)包括啟動(dòng)子區(qū)(5' UTR)、外顯子Ⅰ、內(nèi)含子、外顯子Ⅱ和下游調(diào)控區(qū)(3'UTR)。根據(jù)上游肩動(dòng)子序列的不同，這60個(gè)var基因又可分為5個(gè)亞類:10個(gè)upsA亞類、35個(gè)upsB亞類、13個(gè)upsC亞類、1個(gè)upsD亞類(var假基因)和1個(gè)

3、upsE亞類。大量現(xiàn)場(chǎng)和實(shí)驗(yàn)室的研究表明，var基因轉(zhuǎn)錄的類型與惡性瘧原蟲的致病力（毒力）密切相關(guān)。基于惡性瘧原蟲3D7標(biāo)準(zhǔn)株的研究表明，var基因的表達(dá)具有“排他性”，即var基因家族每次只有一個(gè)獲得表達(dá)，剩余成員都處于沉默狀態(tài)，從而保護(hù)其有限的PfEMP1抗原庫(kù)不被人體免疫系統(tǒng)完全識(shí)別。大量研究已證明，這種排他性表達(dá)主要受到基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，其機(jī)制涉及細(xì)胞核內(nèi)結(jié)構(gòu)、染色質(zhì)修飾、非編碼區(qū)等表觀遺傳學(xué)因素。而且惡性瘧原蟲的var基因

4、能夠進(jìn)行表達(dá)更替(expression switching)，通過這種“克隆變異”機(jī)制不斷改變其所寄生的紅細(xì)胞膜表面抗原類型，從而在宿主體內(nèi)實(shí)現(xiàn)免疫逃避。但是對(duì)于var基因表達(dá)更替的規(guī)律及其機(jī)制，目前尚無(wú)明確的結(jié)論。基于實(shí)驗(yàn)室蟲株的研究顯示，var基因的更替并非隨機(jī)的，而是具有高度的有序性和保守性，起始優(yōu)勢(shì)的var基因決定了后續(xù)表達(dá)的var基因類型;此外，對(duì)于某個(gè)var基因，其轉(zhuǎn)錄上調(diào)或者下調(diào)的速率也是固定的。
　　 盡管var

5、基因表達(dá)規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制的研究一直是瘧疾基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)，但是迄今這方面的研究成果大多來自實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期培養(yǎng)的蟲株，如3D7標(biāo)準(zhǔn)株等。一些研究顯示，惡性瘧原蟲經(jīng)歷體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后，由于寄生環(huán)境的改變和宿主免疫壓力的缺失，導(dǎo)致某些蟲體特征發(fā)生改變，包括被感染紅細(xì)胞表面“knob”結(jié)構(gòu)的消失、強(qiáng)毒力相關(guān)的upsA亞類var基因快速沉默等。這些現(xiàn)象提示，對(duì)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)蟲株var基因研究獲得的相關(guān)結(jié)論未必能反映野生型蟲株中的實(shí)際情況，因此，開展惡性瘧原蟲

6、野生型蟲株var基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)機(jī)制的研究顯得十分必要。但是由于不同蟲株間var基因序列高度變異，同源性小于50％，給野生株var基因序列信息的獲得帶來了困難，阻礙了對(duì)惡性瘧原蟲野生株var基因家族的研究。對(duì)此，本研究選用中緬邊境地區(qū)新分離的惡性瘧原蟲野生蟲株，通過有限稀釋克隆法獲得野生蟲株的克隆品系，并利用全基因組測(cè)序和var基因拼接獲得野生型克隆的var基因序列。隨后，我們依此設(shè)計(jì)每個(gè)var基因的特異性引物，用于檢測(cè)和分析惡性瘧原蟲野生

7、株的var基因轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律，取得了以下研究結(jié)果:
　　 1.惡性瘧原蟲野生株FCYN0906的培養(yǎng)和克隆化
　　 惡性瘧原蟲野生株FCYN0906采集于中緬邊境的拉咱市，液氮冷凍并用干冰保存運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。按照標(biāo)準(zhǔn)的野生株復(fù)蘇和培養(yǎng)方法，建立該蟲株的體外連續(xù)培養(yǎng)。采用瘧原蟲有限稀釋法，對(duì)該蟲株進(jìn)行克隆化:將原蟲懸液稀釋至每200微升0.01-0.5個(gè)原蟲至96孔板，經(jīng)過14至28天的培養(yǎng)，共獲得了6個(gè)瘧原蟲克隆，分別定名為F

8、CYN0906-4A、FCYN0906-4C、FCYN0906-4H、FCYN0906-5H、FCYN0906-6G和FCYN0906-6E。為確定這些克隆的基因型，我們利用本實(shí)驗(yàn)室先期建立的惡性瘧原蟲微衛(wèi)星多態(tài)性分析的技術(shù)平臺(tái)，選擇8個(gè)代表性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，即ARA2、TA1、TA60、TA81、TA87、TA109、PfPK2和Polyα，采用半巢式PCR的方法，對(duì)6個(gè)克隆品系的基因組進(jìn)行擴(kuò)增，并利用Genscan方法檢測(cè)各微衛(wèi)星片段

9、的長(zhǎng)度。結(jié)果顯示，克隆FCYN0906-4C、4H、5H和6G在這8個(gè)位點(diǎn)上的微衛(wèi)星長(zhǎng)度完全一致，表明這4個(gè)克隆屬于同一基因型的克隆品系。而克隆FCYN0906-4A和6E，其微衛(wèi)星長(zhǎng)度在一些位點(diǎn)上與其他4個(gè)克隆不一致，提示其具有不同的基因型。因此本研究選用了惡性瘧原蟲野生株克隆FCYN0906-4C、4H、5H和6G進(jìn)行后續(xù)研究。
　　 2.惡性瘧原蟲野生株克隆FCYN0906-5H的全基因組測(cè)序和var基因序列的組裝

10、　　 基于上述微衛(wèi)星檢測(cè)結(jié)果顯示4個(gè)瘧原蟲克隆具有相同的基因型，我們選用其中的FCYN0906-5H做Solexa全基因組測(cè)序。大量制備基因組DNA，并且通過檢測(cè)18SrRNA排除宿主DNA的污染。全基因組測(cè)序共獲得10，259，515對(duì)序列片段(reads)，讀長(zhǎng)為100bp。以已發(fā)布的3D7標(biāo)準(zhǔn)株基因組為參考序列，采用Bowtie2軟件進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示，93.15％的序列能比對(duì)到3D7基因組上，平均基因組覆蓋率達(dá)90倍。然而

11、，由于不同惡性瘧原蟲之間var基因序列變異度很大，特別是var基因序列高變區(qū)，因此，能覆蓋每條染色體上var基因可變區(qū)域序列的豐度很低，而覆蓋var基因相對(duì)保守區(qū)域序列豐度較高。為解決該難題，我們采用VelVet軟件對(duì)該野生型克隆的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了重新組裝，選取了8281個(gè)長(zhǎng)度大于500bp的序列重疊群(contigs)，圍繞DBLα結(jié)構(gòu)域進(jìn)行var基因序列的拼接。
　　 首先，我們從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載了所有的PfEMP1蛋白序

12、列并建庫(kù)，用8281個(gè)contigs與之做Blastx比對(duì)，共找到217個(gè)和PfEMP1相關(guān)的contigs，采用VarDom1.0Service預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域，包括N末端區(qū)(NTS)、Duffy樣結(jié)合區(qū)(DBL)、富含半胱氨酸樣區(qū)(CIDR)、酸性末端區(qū)(ATS)，結(jié)果找到DBLα相關(guān)的contigs66個(gè)，其中47個(gè)包含了DBLα最常見的相對(duì)保守蛋白序列DIGDI及PQYLR;對(duì)于另外19個(gè)contigs，我們根據(jù)其各自的DBLα高變區(qū)

13、序列設(shè)計(jì)一條引物，結(jié)合該結(jié)構(gòu)域的上游通用引物(DBLαAF)及下游通用引物(DBLαBR)，利用PCR擴(kuò)增和測(cè)序，獲得19個(gè)DBLα相關(guān)序列并與之前47個(gè)contigs拼接。最終，利用這66個(gè)contigs一共拼接出50個(gè)含有完整DBL6α結(jié)構(gòu)域的序列。如前所述，根據(jù)var基因上游序列，可將var基因家族分為不同的亞類，對(duì)此，我們提取這50個(gè)contigs的上游序列進(jìn)行亞類預(yù)測(cè)，并利用根據(jù)3D7株序列設(shè)計(jì)的upsA類、upsB類和ups

14、C類var基因通用上游引物，PCR擴(kuò)增出部分?jǐn)?shù)據(jù)缺失的上游序列進(jìn)行測(cè)序后加以驗(yàn)證。結(jié)果顯示，這50個(gè)contigs中，有36個(gè)含有上游序列可以進(jìn)行分類預(yù)測(cè)，另外14個(gè)未獲得上游序列，但是其中2個(gè)DBLα序列(var84，var4)具有明顯的upsA類特征，據(jù)此我們將50個(gè)contigs歸類為:11個(gè)upsA類、18個(gè)upsB類、7個(gè)upsC類、1個(gè)upsD類和1個(gè)upsE類，剩下12個(gè)的分類未知。這50個(gè)contigs能夠代表克隆FCY

15、N0906-5H的var基因家族，其理由是:(1)已完成基因組測(cè)序的3D7標(biāo)準(zhǔn)株、HB3株及IT4株，其所有var基因一般均含有一個(gè)DBLα結(jié)構(gòu)域，而我們拼接的50個(gè)var基因也都含有DBLα結(jié)構(gòu)域，且進(jìn)化樹中能夠與其他的DBL（β-ε）區(qū)分開;(2)這50個(gè)var基因中，有42個(gè)含有NTS結(jié)構(gòu)域，另外4個(gè)也含有var基因5'端常見的DBLα-CIDRα結(jié)構(gòu)。
　　 3.惡性瘧原蟲野生株各var基因特異引物的設(shè)計(jì)和擴(kuò)增效率分析<

16、br>　　 為研究惡性瘧原蟲野生株FCYN0906各個(gè)克隆的var基因轉(zhuǎn)變規(guī)律，我們需要分別設(shè)計(jì)針對(duì)50個(gè)var基因的特異性引物用于熒光定量PCR(qRT-PCR)分析，檢測(cè)每個(gè)var基因的轉(zhuǎn)錄水平。對(duì)此，我們根據(jù)克隆FCYN0906-5H的50個(gè)var基因DBLα高變區(qū)序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的特異性引物。為驗(yàn)證各引物的擴(kuò)增效率和特異性，我們將克隆FCYN0906-5H的基因組DNA連續(xù)10倍稀釋后，檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率，結(jié)果顯示，這50對(duì)引物

17、擴(kuò)增效率為98％-100％，并且溶解曲線峰單一。由于上述微衛(wèi)星結(jié)果顯示FCYN0906-4C、4H、5H和6G的基因型一致，我們用這50對(duì)引物對(duì)4個(gè)克隆的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果顯示所有引物在FCYN0906-4C、4H和6G中均能有效擴(kuò)增，序列分析結(jié)果顯示這4個(gè)克隆var基因序列完全一致，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)FCYN0906-4C、4H、5H和6G這4個(gè)克隆基因型的一致性。
　　 4.FCYN0906各個(gè)克隆var基因排

18、他性表達(dá)分析
　　 基于惡性瘧原蟲3D7標(biāo)準(zhǔn)株的研究認(rèn)為，var基因家族具有“排他性”表達(dá)規(guī)律，即每個(gè)瘧原蟲在其單個(gè)紅內(nèi)期周期內(nèi)，只有一個(gè)var基因能獲得優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，我們一般稱這個(gè)獲得表達(dá)的成員為“優(yōu)勢(shì)var基因”。這種表達(dá)模式的一個(gè)合理解釋是:保護(hù)惡性瘧原蟲最主要的表面抗原庫(kù)（PfEMP1家族），避免其由于被宿主免疫系統(tǒng)完全識(shí)別而快速耗竭，這可能也是惡性瘧原蟲能夠在人體內(nèi)建立長(zhǎng)期慢性感染的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。由于缺乏完整的var基

19、因家族序列，對(duì)野生型蟲株var基因的研究還停留在利用基于DBLα保守區(qū)的通用引物進(jìn)行PCR—克隆—測(cè)序以及頻率分析，從而間接獲得野生株中各個(gè)var基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，因此在惡性瘧原蟲野生型蟲株中var基因是否同樣為排他性表達(dá)還未能加以證實(shí)。而本課題利用針對(duì)惡性瘧原蟲克隆FCYN0906-5H的50個(gè)var基因分別設(shè)計(jì)定量分析引物，對(duì)該野生株的var基因家族轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行系統(tǒng)的定量分析。我們將凍存的克隆FCYN0906-4C、4H、5H和6

20、G復(fù)蘇后，進(jìn)行嚴(yán)格的同步化處理，并收集環(huán)狀體期的總RNA(10-15h)，去除基因組DNA污染后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA后，用50對(duì)var基因特異性引物分別檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄水平。在復(fù)蘇后20天檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)克隆分別具有不同的優(yōu)勢(shì)var基因，其中4C株優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄var167，占所有var基因轉(zhuǎn)錄水平的61％;4H株優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄var15，占所有var基因轉(zhuǎn)錄水平的69％;5H株優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄var51，占所有var基因轉(zhuǎn)錄水平的44％;6G株優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄

21、var47，占所有var基因轉(zhuǎn)錄水平的57％。在這4個(gè)克隆中，轉(zhuǎn)錄水平居于第二位的var基因僅占總轉(zhuǎn)錄水平的5％-13％。在3D7標(biāo)準(zhǔn)株中檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)var基因所占百分比為40％-80％，由此可見，惡性瘧原蟲野生型克隆中的var基因家族也具有“排他性”表達(dá)的規(guī)律。
　　 5.FCYN0906各個(gè)克隆在體外培養(yǎng)過程中var基因轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律的系統(tǒng)分析
　　 迄今為止，關(guān)于var基因家族的研究大多集中在其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制上，

22、但仍有少數(shù)研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室蟲株的var基因轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，var基因的轉(zhuǎn)變并非是隨機(jī)的，而是具有高度的有序性和保守性。var基因家族的“排他性”表達(dá)及高度有序的更替是惡性瘧原蟲表面抗原“克隆變異”現(xiàn)象的重要分子基礎(chǔ)。然而，對(duì)于var基因轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律的研究，主要也是在3D7標(biāo)準(zhǔn)株中進(jìn)行的，而野生型蟲株的var基因家族序列信息不全，難以特異性地檢測(cè)每個(gè)var基因的轉(zhuǎn)錄水平。鑒于野生型蟲株與實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期培養(yǎng)蟲株的顯著差異，很有必要在

23、野生型蟲株中對(duì)該科學(xué)問題開展系統(tǒng)的分析。在本課題中，我們組裝了野生型克隆FCYN0906-5H的50個(gè)var基因，并且設(shè)計(jì)了各自特異性的引物，從而可以對(duì)野生株var基因轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律開展進(jìn)一步的研究。于是我們將上述的4個(gè)野生型克隆培養(yǎng)物各自分成2個(gè)分瓶后進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，每間隔10代檢測(cè)一次var基因轉(zhuǎn)錄譜的變化情況，共檢測(cè)了5個(gè)時(shí)間點(diǎn);同時(shí)，我們又對(duì)這4個(gè)克隆做了第二次完全獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，保證實(shí)驗(yàn)過程及檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)與上一次實(shí)驗(yàn)一致。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

24、起始優(yōu)勢(shì)var基因不同的4個(gè)克隆具有不同的var基因轉(zhuǎn)錄變化途徑，表明起始優(yōu)勢(shì)var基因會(huì)影響接下來轉(zhuǎn)錄的var基因類型，如克隆4C起始優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄的為var167，接下來得到優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄的有var98，var143，var21，var45;而在克隆6G中起始優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄的為var47，則接下來得到優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄的為var136，var163，var21。令人感興趣的是，同一克隆的4個(gè)不同分瓶之間，var基因的轉(zhuǎn)錄變化方向也不盡相同，表明野生型蟲株中va

25、r基因的轉(zhuǎn)變具有一定的隨機(jī)性，如克隆4C的兩個(gè)分瓶4C-C及4C-D在起始優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄的var167逐漸下調(diào)后，都有var98，var21，var143的上調(diào)，但是分瓶4C-C選擇優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄var143，而分瓶4C-D則選擇優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄var21。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株不同，野生型蟲株中單個(gè)var基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)或下調(diào)速率并不是固定的，如var98在分瓶4C-B中上調(diào)的速率高，能達(dá)到每代2.7％，而在分瓶4C-D中上調(diào)速率每代約0.3％，這種

26、上調(diào)或者下調(diào)速率的可變性，同樣造成了不同分瓶之間var基因變化方向的多樣性。但是從整體上分析，這些來自于同一個(gè)野生株的克隆及其分瓶在var基因轉(zhuǎn)錄變化過程中，仍然具有一定的保守性，如克隆6G的分瓶6G-C及6G-D，都經(jīng)歷了var47的下調(diào)，var21，var136，var170的上調(diào)，最后都選擇優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄var163，其var基因轉(zhuǎn)變的途徑相當(dāng)一致;var21不儀在多個(gè)克隆中成為最終的優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄基因，而且在4個(gè)克隆var基因的各條轉(zhuǎn)變路線

27、中都起了重要的過渡作用，可能代表了野生株FCYN0906的一個(gè)偏好var基因。
　　 因此，我們認(rèn)為，野生型蟲株var基因家族的轉(zhuǎn)錄變化規(guī)律包含了兩個(gè)層面:有序保守性及隨機(jī)性。同時(shí)，起始優(yōu)勢(shì)var基因的類型、不同野生株偏好的var基因類型以及不同var基因成員的轉(zhuǎn)錄上調(diào)或下調(diào)速率特征影響了var基因的轉(zhuǎn)變方向。
　　 此外，惡性瘧原蟲野生株在體外培養(yǎng)過程中，雖然大部分upsA類var基因的轉(zhuǎn)錄水平都很低，但偶爾還是有個(gè)別

28、upsA類var基因的上調(diào)及優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄，在無(wú)選擇壓力條件下，上調(diào)可能是隨機(jī)的，不具有重復(fù)性。
　　 小結(jié):本研究分離了我國(guó)云南邊境地區(qū)一株惡性瘧原蟲野生株并建立了體外培養(yǎng)。通過單克隆的方法獲得了該蟲株的克隆品系。通過對(duì)其中一個(gè)克隆全基因組測(cè)序，拼接了其50個(gè)var基因，并根據(jù)上游序列將這些var基因分類。根據(jù)var基因高變區(qū)序列，設(shè)計(jì)了50對(duì)特異性引物，采用realtimePCR方法定量分析了該野生蟲株4個(gè)克隆在體外培養(yǎng)過程中va

29、r基因轉(zhuǎn)錄類型及其轉(zhuǎn)變規(guī)律，結(jié)果顯示該野生蟲株var基因仍為排他性表達(dá)，且4個(gè)克隆及同一克隆不同分瓶之間，var基因轉(zhuǎn)變方向各不相同。本研究首次從單個(gè)var基因水平上系統(tǒng)分析了惡性瘧原蟲野生株中var基因的轉(zhuǎn)錄水平及其轉(zhuǎn)變規(guī)律，首次提出了野生株中var基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)與下調(diào)速率的可變性，并且根據(jù)我們的結(jié)果，提出var基因轉(zhuǎn)變過程是隨機(jī)性及保守性相結(jié)合的，而以往從實(shí)驗(yàn)室蟲株中得出的關(guān)于var基因轉(zhuǎn)變方向隨機(jī)性或者保守性的結(jié)論都是片面的。根據(jù)已

30、有的文獻(xiàn)資料，結(jié)合本課題對(duì)惡性瘧原蟲野生株的研究結(jié)果，我們總結(jié)出惡性瘧原蟲var基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)變規(guī)律如下:1）野生型克隆中var基因?yàn)榕潘员磉_(dá);2）var基因上調(diào)與下調(diào)的速率具有可變性，即優(yōu)勢(shì)var基因可繼續(xù)保持優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄，或迅速下調(diào)、緩慢下調(diào)，并被另一個(gè)優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄的var基因取代;3）起始優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄的var基因類型可影響接下來上調(diào)的var基因類型，且存在一定偏好性;4）起始優(yōu)勢(shì)的var基因在繼續(xù)優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄或者逐漸下調(diào)的過程中，其他var基因遵