miR--503和miR--135a靶向Zfp217在成脂分化上的作用機(jī)制研究.pdf

1、脂肪細(xì)胞主要是由起源于中胚層的多能間充質(zhì)干細(xì)胞逐漸分化或發(fā)育而來(lái)。由間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育為成熟脂肪細(xì)胞包含定型和分化兩個(gè)過(guò)程，這兩個(gè)過(guò)程受到高度協(xié)調(diào)而且復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。動(dòng)物從胚胎發(fā)育持續(xù)到成年都存在脂肪形成的過(guò)程。近年來(lái)，研究報(bào)道鋅指蛋白基因參與成脂分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，不僅能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的成脂定型，也能調(diào)節(jié)細(xì)胞的成脂分化和脂肪沉積。值得注意的是，與脂質(zhì)代謝相關(guān)的鋅指蛋白基因受miRNA調(diào)控，進(jìn)而影響脂肪細(xì)胞分化的研究逐漸被報(bào)道。本課題組在前期

2、的研究中，將豬原代脂肪來(lái)源的血管基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)成脂分化，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)篩選出1個(gè)保守的脂肪SV細(xì)胞成脂分化的差異表達(dá)基因Zfp217，通過(guò)RNAi技術(shù)初步確定了其在豬源脂肪SV細(xì)胞成脂分化過(guò)程中的作用。但其在細(xì)胞成脂定型和分化上的功能以及如何受miRNA調(diào)控而影響脂肪細(xì)胞的分化作用尚不清楚。主要研究結(jié)果如下:
　　1.鋅指蛋白Zfp217的生物信息學(xué)分析
　　運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)分析了Zfp217的多級(jí)結(jié)

3、構(gòu)和序列特征，結(jié)果顯示:在三個(gè)物種(hsa、mmu和ssc)中，Zfp217均含有8個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，且第6個(gè)和第7個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)在三個(gè)物種中的序列相似性最高;利用同源建模方法構(gòu)建了構(gòu)象符合立體化學(xué)規(guī)則的Zfp217蛋白序列三維結(jié)構(gòu)模型;Zfp217蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明其在三個(gè)物種中均為親水性蛋白，熱穩(wěn)定性低且其氨基酸序列不穩(wěn)定;分析Zfp217的跨膜結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，只在鼠和豬中預(yù)測(cè)到跨膜結(jié)構(gòu)域;轉(zhuǎn)錄后修飾顯示:在人、鼠和豬中都預(yù)測(cè)到了O-GalN

4、Ac蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)。
　　利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Zfp217在真核生物多個(gè)物種中的蛋白序列，構(gòu)建同源進(jìn)化樹(shù)，分析各物種蛋白序列的鋅指結(jié)構(gòu)基序。結(jié)果顯示:從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，哺乳動(dòng)物綱是其中最大的一類(lèi)，各個(gè)綱或目之間界限分明，相同的綱或目?jī)?nèi)物種的序列具有更好的同源性且高度保守。C2H2類(lèi)鋅指結(jié)構(gòu)基序廣泛地分布在各個(gè)物種的序列中，并且數(shù)目從5到8個(gè)不等，數(shù)目為8的物種占絕大多數(shù)。
　　利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Zfp217

5、功能獲得或功能缺失條件下的芯片數(shù)據(jù)集，對(duì)檢索的數(shù)據(jù)集利用R語(yǔ)言分析獲得了4個(gè)基因與fp217表達(dá)水平的變化相一致，33個(gè)基因相反。對(duì)這些獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)它們富集在具有較高的生物活性過(guò)程中，并且富集在腫瘤癌癥相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程上。利用GEO數(shù)據(jù)挖掘獲得121個(gè)乳腺癌差異表達(dá)miRNA，其中19個(gè)預(yù)測(cè)到在人和鼠Zfp217的3'UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。在嚴(yán)格的篩選條件下，共預(yù)測(cè)到164個(gè)保守的miRNA靶向作用Zfp217

6、，進(jìn)一步文獻(xiàn)挖掘發(fā)現(xiàn)，其中102個(gè)miRNA與癌癥相關(guān)，關(guān)聯(lián)性最大的癌癥是乳腺癌。此外，數(shù)據(jù)挖掘還顯示Zfp217與肥胖和成脂分化標(biāo)記基因高度相關(guān)。因此，推測(cè)Zfp217可能參與成脂分化過(guò)程，并受miRNA的調(diào)控。
　　2.Zfp217的表達(dá)與功能研究
　　利用QPCR或Western blot分析了Zfp217在C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化過(guò)程、豬和鼠不同組織以及肥胖小鼠模型脂肪組織中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示:Zfp217在

7、C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化過(guò)程中的上調(diào)表達(dá)與成脂分化核心轉(zhuǎn)錄因子基因Pparg2相一致。在內(nèi)臟脂肪組織中，Zfp217與Pparg2的表達(dá)趨勢(shì)相一致，并呈現(xiàn)出相似的顯著性。Zfp217的表達(dá)與一些促進(jìn)成脂分化的早期標(biāo)志基因（Cebpb，KLF4，Ebf1和ZNF395）的表達(dá)模式相一致。
　　克隆了鼠Zfp217基因編碼區(qū)，探討了在Zfp217功能獲得或功能缺失情況下對(duì)細(xì)胞成脂分化的影響，結(jié)果顯示:Zfp217功能獲得或缺失與

8、C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化的脂滴形成以及甘油三酯含量呈正相關(guān)。利用QPCR、流式細(xì)胞術(shù)、哺乳動(dòng)物雙雜交等試驗(yàn)分析了Zfp217調(diào)控細(xì)胞成脂分化的機(jī)制，結(jié)果顯示:Zfp217超表達(dá)能夠顯著抑制Wnt信號(hào)基因的mRNA水平。此外，細(xì)胞成脂誘導(dǎo)4d時(shí)，成脂標(biāo)記基因在Zfp217的不同處理組發(fā)生顯著性改變。雙雜交試驗(yàn)顯示在鼠源背景下，Zfp217與Ezh2存在蛋白互作。表明Zfp217促進(jìn)細(xì)胞成脂分化是通過(guò)抑制細(xì)胞DNA合成，影響細(xì)胞周期，

9、并與Ezh2互作抑制Wnt信號(hào)基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
　　3.靶向作用Zfp217的miRNA篩選、驗(yàn)證及功能研究
　　利用多種生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)靶向作用fp217的miRNA:在人中共預(yù)測(cè)到176個(gè)，在鼠中共預(yù)測(cè)到213個(gè)，在人和鼠中共同出現(xiàn)的miRNA有42個(gè)。利用功能注釋和進(jìn)化分析進(jìn)一步篩選出了5個(gè)候選miRNA:miR-503、miR-135a、miR-26a、miR-19a/b和miR-1a。利用雙熒光素酶試驗(yàn)、

10、QPCR和Western blot驗(yàn)證了miR-503、miR-135a和miR-19a可以通過(guò)靶向結(jié)合Zfp2173'非翻譯區(qū)(3'untranslated region，3'UTR)降低Zfp217在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
　　分析了候選miRNA在C3H10T1/2細(xì)胞成脂分化過(guò)程中、豬和鼠不同組織中以及肥胖小鼠模型五種脂肪組織中的表達(dá)模式。利用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)了miR-503和miR-135a對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞DNA合成的