miR-217負(fù)調(diào)控MTDH抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲等作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　肝細(xì)胞癌（肝癌）在全球惡性腫瘤中發(fā)病率居第五位，死亡率居第三位。由于早期無(wú)特異表現(xiàn)、治療后易復(fù)發(fā)，肝癌病人整體預(yù)后較差，是威脅人類(lèi)健康的重大醫(yī)療問(wèn)題。因此，尋找用于精準(zhǔn)早期診斷的的生物標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)是肝癌研究的重點(diǎn)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)miR-217已被證實(shí)在胃癌、前列腺癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，但是在肝癌中miR-217的作用機(jī)制仍不明確。
　　異黏蛋白(MTDH)是一種含582個(gè)氨基酸的單跨膜蛋白，其在多種腫瘤中

2、均有異常高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤的進(jìn)展正相關(guān)。MTDH基因的表達(dá)還與癌癥進(jìn)展的階段、分期、以及預(yù)后相關(guān)。MTDH基因通過(guò)調(diào)控癌癥過(guò)程中的多個(gè)信號(hào)通路參與癌癥進(jìn)程，因此MTDH是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。目前對(duì)于MTDH在肝癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究還比較少。
　　miRNA能通過(guò)間接或者直接調(diào)控MTDH的的表達(dá)，在結(jié)直腸癌中是miRNA間接調(diào)控MTDH，在乳腺癌、人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中都是miRNA直接調(diào)控MTDH的實(shí)例，然而對(duì)于miR-2

3、17與MTDH的關(guān)系尚不明確。通過(guò)對(duì)患者肝癌組織和HepG2細(xì)胞的研究，探索miRNA-217介導(dǎo)MTDH在肝癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)研究及作用機(jī)制。
　　目的：
　　1.檢測(cè)miR-217和MTDH在肝癌和癌旁組織中的差異性表達(dá)，探討其相關(guān)性;
　　2.驗(yàn)證miR-217與MTDH基因的靶向作用關(guān)系;
　　3.檢測(cè)miR-217對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響。
　　方法：
　　1.自南

4、方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院病理科收集20例肝癌和癌旁組織，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot檢測(cè)其中miR-217、MTDH mRNA和蛋白水平的表達(dá);
　　2.通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)miR-217與MTDH的結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建MTDH基因3'-UTR區(qū)的野生型和突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，與miR-217mimics共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測(cè)其熒光表達(dá)變化。在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-217，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PC

5、R、Western Blot及免疫熒光分別檢測(cè)細(xì)胞中MTDH的mRNA和蛋白的表達(dá)變化，驗(yàn)證miR-217對(duì)MTDH的靶向作用;
　　3.在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-217，通過(guò)MTT、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-217對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)特性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在20例肝癌和癌旁組織中，miR-217在肝癌中的表達(dá)量較癌旁組織明顯降低(40％)，而MTDH mRNA

6、在肝癌中較癌旁組織表達(dá)高近一倍，MTDH蛋白水平的表達(dá)mRNA水平一致。
　　2.通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-217mimics，成功在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-217，miR-217顯著抑制野生型MTDH3'-UTR載體的熒光強(qiáng)度，對(duì)突變型MTDH3'-UTR載體無(wú)明顯作用。過(guò)表達(dá)miR-217明顯抑制HepG2細(xì)胞中MTDH mRNA和蛋白的表達(dá)，證明了miR-217直接靶向于MTDH基因的3'-UTR區(qū)，從而抑制MTDH基因的表達(dá)。

7、
　　3.在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-217，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn):較之空白及陰性對(duì)照組，過(guò)表達(dá)miR-217能顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，并增加處于G1期、減少S期的HepG2細(xì)胞;同時(shí)，過(guò)表達(dá)miR-217，促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡;Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-217后，轉(zhuǎn)移到下室中的細(xì)胞明顯減少，證明miR-217顯著抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲。
　　結(jié)論：
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