白介素35基因治療協(xié)同地西他濱抑制小鼠心臟移植排斥反應(yīng)的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)研究白介素35(interleukin35，IL-35)基因表達(dá)質(zhì)粒載體聯(lián)合甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱(decitabine)對(duì)小鼠免疫功能尤其是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平和功能的影響；采用小鼠尾靜脈快速注射質(zhì)粒載體的方法研究體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染效果，篩選相對(duì)高效IL-35質(zhì)粒劑量組；建立穩(wěn)定的小鼠腹腔異位心臟移植模型，經(jīng)尾靜脈注射IL-35質(zhì)粒載體協(xié)同地西他濱聯(lián)合干預(yù)受體，觀察其對(duì)受體調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平和同種異系小鼠心臟移植

2、排斥反應(yīng)的影響，探索出誘導(dǎo)移植免疫耐受的新途徑。
　　 第一部分、IL-35及地西他濱對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠T淋巴細(xì)胞的作用研究
　　 目的：酶切鑒定小鼠IL-35質(zhì)粒載體，探討體外IL-35和地西他濱對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞的作用，研究其負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。
　　 方法：酶切鑒定英國格拉斯哥大學(xué)惠贈(zèng)IL-35質(zhì)粒，設(shè)計(jì)目的基因IL-35的上下游引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，合成目的基因IL-35；通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

3、染法，體外轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞系293細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液中IL-35的濃度，分析IL-35基因表達(dá)情況；進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，觀察IL-35及地西他濱處理后對(duì)培養(yǎng)體系的影響，以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)體系T細(xì)胞亞群和CD4+CD25+Treg比例。
　　 結(jié)果：IL-35質(zhì)粒載體鑒定成功；質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清液中有IL-35表達(dá)；IL-35及地西他濱上調(diào)體

4、外同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中的CD4+CD25+Treg比例，下調(diào)CD4+CD8-T細(xì)胞比例。
　　 第二部分、IL-35體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠免疫功能的影響
　　 目的：評(píng)價(jià)經(jīng)小鼠尾靜脈注射質(zhì)粒載體方法進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染的效果，探討IL-35基因轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠免疫功能的影響，并篩選相對(duì)高效IL-35質(zhì)粒劑量組。
　　 方法：設(shè)置空質(zhì)粒對(duì)照組和目的基因質(zhì)粒載體組，經(jīng)鼠尾靜脈流體力學(xué)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體，體內(nèi)干預(yù)小鼠，流式細(xì)胞技術(shù)檢

5、測(cè)轉(zhuǎn)染第3、5、7天后外周血和脾臟組織中T細(xì)胞亞群、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、NK細(xì)胞比例。
　　 結(jié)果：經(jīng)鼠尾靜脈注射質(zhì)粒載體方法可使IL-35目的基因在體內(nèi)表達(dá)；IL-35引起小鼠體內(nèi)外周血及脾臟CD4+CD25+Treg比例上調(diào)，外周血CD4+CD8-T細(xì)胞、CD3-CD16+NK細(xì)胞比例下調(diào)；篩選出IL-35相對(duì)高效轉(zhuǎn)染質(zhì)粒劑量為50ug。
　　 第三部分、IL-35基因轉(zhuǎn)染協(xié)同地西他濱在同種異系小鼠心臟移植中的抗排斥反應(yīng)作

6、用研究
　　 目的：觀察受體小鼠尾靜脈注射IL-35質(zhì)粒載體及地西他濱對(duì)同種異系小鼠心臟移植排斥反應(yīng)的作用，探討其抗排斥機(jī)制。
　　 方法：建立小鼠異位腹腔心臟移植模型；設(shè)置異系對(duì)照組、空質(zhì)粒對(duì)照組、IL-35質(zhì)粒載體處理組、地西他濱處理組、IL-35質(zhì)粒協(xié)同地西他濱處理組。觀察各組移植心臟存活時(shí)間，評(píng)定術(shù)后7天移植物排斥反應(yīng)病理分級(jí)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)術(shù)后7天外周血及脾臟組織T細(xì)胞亞群及CD4+CD25+Treg的變化水平

7、。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建同種異系小鼠腹腔異位心臟移植模型。與異系對(duì)照組(中位生存期8天)和空質(zhì)粒Fc組(中位生存期7天)相比，IL-35質(zhì)粒載體處理組(中位生存期10天)、地西他濱處理組(中位生存期11天)和IL-35質(zhì)粒協(xié)同地西他濱處理組(中位生存期12天)移植心臟存活時(shí)間明顯延長(P<0.01)；IL-35質(zhì)粒載體處理組、地西他濱處理組和IL-35質(zhì)粒協(xié)同地西他濱處理組術(shù)后7天移植心的急性排斥反應(yīng)病理分級(jí)較異系對(duì)照組明顯降低

8、(P<0.01)；與異系對(duì)照組和空質(zhì)粒Fc組相比，IL-35質(zhì)粒載體處理組、地西他濱處理組和IL-35質(zhì)粒協(xié)同地西他濱處理組術(shù)后7天外周血和脾臟CD4+CD25+Treg比例均明顯升高(P<0.01)，外周血CD4-CD8+T細(xì)胞水平均明顯降低(P<0.01)。
　　 結(jié)論：小鼠異位腹腔心臟移植模型是研究移植排斥反應(yīng)的理想動(dòng)物模型。IL-35及地西他濱對(duì)同種異系小鼠心臟移植有抗排斥作用，其機(jī)制可能為IL-35及地西他濱刺激CD4