白介素35基因治療協同地西他濱抑制小鼠心臟移植排斥反應的研究.pdf

1、本實驗研究白介素35(interleukin35，IL-35)基因表達質粒載體聯合甲基轉移酶抑制劑地西他濱(decitabine)對小鼠免疫功能尤其是CD4+CD25+調節(jié)性T細胞表達水平和功能的影響；采用小鼠尾靜脈快速注射質粒載體的方法研究體內基因轉染效果，篩選相對高效IL-35質粒劑量組；建立穩(wěn)定的小鼠腹腔異位心臟移植模型，經尾靜脈注射IL-35質粒載體協同地西他濱聯合干預受體，觀察其對受體調節(jié)性T細胞表達水平和同種異系小鼠心臟移植

2、排斥反應的影響，探索出誘導移植免疫耐受的新途徑。
　　 第一部分、IL-35及地西他濱對體外培養(yǎng)的小鼠T淋巴細胞的作用研究
　　 目的：酶切鑒定小鼠IL-35質粒載體，探討體外IL-35和地西他濱對小鼠T淋巴細胞的作用，研究其負向免疫調節(jié)作用及機制。
　　 方法：酶切鑒定英國格拉斯哥大學惠贈IL-35質粒，設計目的基因IL-35的上下游引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)，合成目的基因IL-35；通過陽離子脂質體轉

3、染法，體外轉染人腎上皮細胞系293細胞，流式細胞術(FCM)分析細胞轉染效率以及酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測轉染后細胞上清液中IL-35的濃度，分析IL-35基因表達情況；進行單向混合淋巴細胞培養(yǎng)，觀察IL-35及地西他濱處理后對培養(yǎng)體系的影響，以流式細胞技術檢測培養(yǎng)體系T細胞亞群和CD4+CD25+Treg比例。
　　 結果：IL-35質粒載體鑒定成功；質粒載體轉染的細胞上清液中有IL-35表達；IL-35及地西他濱上調體

4、外同種異體混合淋巴細胞反應體系中的CD4+CD25+Treg比例，下調CD4+CD8-T細胞比例。
　　 第二部分、IL-35體內基因轉染對小鼠免疫功能的影響
　　 目的：評價經小鼠尾靜脈注射質粒載體方法進行體內轉染的效果，探討IL-35基因轉染對小鼠免疫功能的影響，并篩選相對高效IL-35質粒劑量組。
　　 方法：設置空質粒對照組和目的基因質粒載體組，經鼠尾靜脈流體力學轉染質粒載體，體內干預小鼠，流式細胞技術檢

5、測轉染第3、5、7天后外周血和脾臟組織中T細胞亞群、調節(jié)性T細胞、NK細胞比例。
　　 結果：經鼠尾靜脈注射質粒載體方法可使IL-35目的基因在體內表達；IL-35引起小鼠體內外周血及脾臟CD4+CD25+Treg比例上調，外周血CD4+CD8-T細胞、CD3-CD16+NK細胞比例下調；篩選出IL-35相對高效轉染質粒劑量為50ug。
　　 第三部分、IL-35基因轉染協同地西他濱在同種異系小鼠心臟移植中的抗排斥反應作

6、用研究
　　 目的：觀察受體小鼠尾靜脈注射IL-35質粒載體及地西他濱對同種異系小鼠心臟移植排斥反應的作用，探討其抗排斥機制。
　　 方法：建立小鼠異位腹腔心臟移植模型；設置異系對照組、空質粒對照組、IL-35質粒載體處理組、地西他濱處理組、IL-35質粒協同地西他濱處理組。觀察各組移植心臟存活時間，評定術后7天移植物排斥反應病理分級；流式細胞術檢測術后7天外周血及脾臟組織T細胞亞群及CD4+CD25+Treg的變化水平

7、。
　　 結果：成功構建同種異系小鼠腹腔異位心臟移植模型。與異系對照組(中位生存期8天)和空質粒Fc組(中位生存期7天)相比，IL-35質粒載體處理組(中位生存期10天)、地西他濱處理組(中位生存期11天)和IL-35質粒協同地西他濱處理組(中位生存期12天)移植心臟存活時間明顯延長(P<0.01)；IL-35質粒載體處理組、地西他濱處理組和IL-35質粒協同地西他濱處理組術后7天移植心的急性排斥反應病理分級較異系對照組明顯降低

8、(P<0.01)；與異系對照組和空質粒Fc組相比，IL-35質粒載體處理組、地西他濱處理組和IL-35質粒協同地西他濱處理組術后7天外周血和脾臟CD4+CD25+Treg比例均明顯升高(P<0.01)，外周血CD4-CD8+T細胞水平均明顯降低(P<0.01)。
　　 結論：小鼠異位腹腔心臟移植模型是研究移植排斥反應的理想動物模型。IL-35及地西他濱對同種異系小鼠心臟移植有抗排斥作用，其機制可能為IL-35及地西他濱刺激CD4