銅蛋白組在鉛致大鼠海馬神經(jīng)損傷中的作用研究.pdf

1、目的：本研究探討銅蛋白組中銅相關(guān)蛋白在鉛致大鼠海馬神經(jīng)損傷中的作用。以其為進(jìn)一步闡明鉛的神經(jīng)毒性作用機(jī)制、從而進(jìn)行鉛暴露標(biāo)志物的篩選。本研究結(jié)果對(duì)鉛中毒進(jìn)行有效的預(yù)防、治療以及早期篩查提供理論依據(jù)。
　　方法：1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理及分組：健康雄性SPF級(jí)F344大鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組和鉛暴露組，采用自由飲水的方式染毒，醋酸鉛組給予0.03％醋酸鉛飲水，對(duì)照組給予0.03%醋酸鈉飲水，連續(xù)染毒9周。2應(yīng)用Morris水迷宮對(duì)大鼠進(jìn)行神

2、經(jīng)行為測試。3應(yīng)用HE染色法觀察大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)變化。4應(yīng)用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）分析大鼠海馬組織中鉛、銅元素含量。5應(yīng)用ELISA和試劑盒方法檢測大鼠海馬中晚期糖基化終末產(chǎn)物含量、過氧化氫含量和抑制羥自由基能力。6采用iTRAQ標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的方法對(duì)鉛暴露大鼠模型海馬組織銅差異蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行檢測，并對(duì)銅差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。7采用蛋白免疫印跡法對(duì)蛋白質(zhì)組中差異銅相關(guān)蛋白CTR1、ATP

3、7A蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測定，驗(yàn)證質(zhì)譜結(jié)果準(zhǔn)確性。8應(yīng)用試劑盒檢測大鼠海馬中銅相關(guān)蛋白超氧化物歧化酶Cu/ZnSOD、銅藍(lán)蛋白CP的活性。9應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測定海馬組織中銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（atp7a、atp7b、ctr1、dmt1）、銅伴侶蛋白（atox1、cox17）和銅儲(chǔ)存蛋白（mt1a、mt2a、mt3）等差異銅相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)情況。數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0分析，計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述以表x±s示，組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，

4、P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1與對(duì)照組比較，鉛暴露組大鼠的逃逸潛伏期長，穿臺(tái)次數(shù)減少（P＜0.05）。2光鏡下觀察可見，鉛暴露組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，大量細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮、破裂。3與對(duì)照組比較，鉛暴露組大鼠海馬組織鉛含量是對(duì)照組大鼠海馬組織鉛含量的3.71倍；鉛暴露組大鼠海馬組織中銅的含量是對(duì)照組大鼠海馬組織銅含量的2.87倍。4鉛暴露大鼠海馬組織中過氧化氫和晚期糖基化終末產(chǎn)物的含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、意義（P<0.05）；鉛暴露大鼠海馬組織抑制羥自由基能力比對(duì)照組下降了9.75%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。5鉛暴露大鼠模型海馬組織中共檢測出5166個(gè)蛋白質(zhì)，根據(jù)蛋白的豐度比即差異倍數(shù)大于1.2倍，P值小于0.05等條件篩選，共檢測出鉛暴露組相對(duì)對(duì)照組共有312個(gè)蛋白質(zhì)有顯著差異。其中，有16個(gè)銅差異蛋白上調(diào)，有12個(gè)銅差異蛋白下調(diào)。6蛋白免疫印跡顯示CTR1蛋白的表達(dá)顯著升高，而ATP7A蛋白表達(dá)水平降低，與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致

6、。7鉛暴露組大鼠海馬組織中Cu/Zn-SOD活性降低了2.73%；CP活性降低了61.08%。8與對(duì)照組比較，鉛暴露組海馬組織中銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白atp7a、atp7b、dmt1的mRNA表達(dá)下降，ctr1的mRNA表達(dá)上升；銅伴侶蛋白atox1、cox17的表達(dá)上升；銅儲(chǔ)存蛋白mt1a、mt2a、mt3的mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：鉛暴露后導(dǎo)致銅在大鼠海馬中蓄積；蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出鉛暴露大鼠海馬組織