CVF和涼膈散對(duì)創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝臟損害機(jī)制的研究.pdf

1、目的：觀察CVF和涼膈散在創(chuàng)傷失血性休克大鼠肝臟損害機(jī)制中的作用。
　　 方法：采用骨折后經(jīng)頸動(dòng)脈放血制備創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，20只Wistar雄性大鼠制作此模型，觀察生命體征變化和肝臟損害；然后將130只Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組1h、3h、6h、24h，蛇毒因子CVF+模型組1h、3h、6h、24h、涼膈散+模型組1h、3h、6h、24h共13組，每組10只大鼠。分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，收集下腔靜脈

2、血液、肝臟，部分肝臟用石蠟包埋制作病理切片。取肝臟，用免疫組化方法檢測(cè)膜攻擊復(fù)合物C5b-9在肝臟的沉積、bax、bcl-2、fas、fasL、Caspase-3、補(bǔ)體片段C5a受體C5a-R表達(dá)；用原位末端缺刻標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。采用Western blot方法檢驗(yàn)C5a-R、Caspase-3在肝臟的表達(dá)。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)肝臟bax、bcl2、fas、fasL基因的表達(dá)。取血漿，用酶聯(lián)免

3、疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血漿中膜攻擊復(fù)合物C5b-9、補(bǔ)體片段C5a、補(bǔ)體總活性CH50濃度，采用速率法測(cè)量天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的濃度。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分、建立創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，死亡率控制在20％，發(fā)現(xiàn)血漿天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST上升，肝臟細(xì)胞出現(xiàn)水腫、壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 第二部分、
　　 1.模型組：
　　 ①補(bǔ)體系統(tǒng)變化：取血漿，模型組1h、3h、6h血漿補(bǔ)體總活性

4、-CH50較假手術(shù)顯著上升，在1h達(dá)高峰值，3h開(kāi)始下降，24h時(shí)較假手術(shù)組顯著下降；在假手術(shù)組血中能檢測(cè)到少量的C5b-9，模型1h、3h、6h較假手術(shù)組顯著上升，1h達(dá)到高峰，24h下降與假手術(shù)組無(wú)顯著性差異；補(bǔ)體片段C5a3h、6h、24h較假手術(shù)組和1h組顯著上升，24h達(dá)峰值；取肝臟，在假手術(shù)組及模型1h、6h肝臟未發(fā)現(xiàn)膜攻擊復(fù)合物C5b-9的沉積，模型24h發(fā)現(xiàn)少量沉積，在模型3h時(shí)門(mén)管區(qū)大量肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞存在C5b-9沉積；

5、肝臟C5a-R mRNA1h、3h、6h、24h較假手術(shù)組顯著上升，6h達(dá)峰值；C5a-R蛋白3h、6h、24h較假手術(shù)組和模型組1h顯著上升，24h達(dá)到峰值；
　　 ②凋亡變化：假手術(shù)組未檢測(cè)到凋亡細(xì)胞，模型組1、6、24h發(fā)現(xiàn)散在凋亡，在模型3h中央靜脈周?chē)蛲雒黠@增加，出現(xiàn)凋亡高峰，與其余各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；bax mRNA、fas mRNA、Bax/Bcl-2蛋白比值和caspase3蛋白在3h達(dá)高峰；fasL在6

6、h達(dá)高峰。
　　 ③天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST在模型1h、3h、6h、24h較假手術(shù)組顯著上升(P均<0.05)，24h達(dá)峰值。病理評(píng)分模型組1h、3h、6h、24h較假手術(shù)組顯著上升，24h達(dá)峰值。
　　 2.應(yīng)用CVF-組
　　 ①補(bǔ)體系統(tǒng)變化：血漿CH50、血漿C5b-9在1h、3h、6h較模型組顯著下降，在24h較模型組顯著上升(P<0.05)；血漿C5a在1h較模型組顯著上升，在3h、6h、24h與模型組均無(wú)

7、顯著性差異(P均>0.05)；未發(fā)現(xiàn)膜攻擊復(fù)合物在肝臟的沉積；C5a-R mRNA1h、3h較模型組顯著上升，蛋白1h、3h、6h較模型組顯著上升；
　　 ②凋亡變化：CVF1h發(fā)現(xiàn)肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡，較模型組顯著上升，3h、6h發(fā)現(xiàn)肝竇內(nèi)淋巴細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于模型組；bax mRNA、蛋白、bax/bcl-2蛋白比值、Caspase3表達(dá)量在3h、6h較模型組顯著下降；3h、24h bcl-2 mRNA、蛋白較模型組

8、顯著下降；在CVF組肝臟未發(fā)現(xiàn)fas及fasL，的表達(dá)；
　　 ③CVF組1h、3h、6h、24h天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)顯著下降，但仍高于假手術(shù)組。病理評(píng)分CVF組1h與假手術(shù)組和模型組無(wú)顯著性差異，CVF3h、6h、24h較模型組顯著降低病理評(píng)分。
　　 第三部分、
　　 ①?zèng)鲭跎⒔M在1h、3h、6h較模型組顯著降低了補(bǔ)體總活性CH50、C5b-9，涼膈敖組24hCH50、C5b-9較模型組上升；C5

9、a在1h、3h較模型組顯著升高，24h較模型組顯著下降；涼膈散組各時(shí)間點(diǎn)血天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)均較模型組顯著降低，3h、6h、24h病理評(píng)分較模型組顯著下降。
　　 ②涼膈散組3h、6h時(shí)發(fā)現(xiàn)肝竇內(nèi)淋巴細(xì)胞凋亡，3h凋亡計(jì)數(shù)較模型組顯著降低；涼膈散組在3h和6h能顯著降低bax、bax/bcl-2蛋白比值、caspase-3表達(dá)量(均P<0.05)，對(duì)Bcl-2基因表達(dá)無(wú)明顯影響(均P>0.05)，且未檢測(cè)到Fas和FasL