纖維堆囊菌基因轉(zhuǎn)化體系建立及埃博霉素生物發(fā)酵和純化工藝研究.pdf

1、來(lái)源于纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)二級(jí)代謝產(chǎn)物的埃博霉素是一種新型抗癌劑,機(jī)制與紫杉醇相似,能夠穩(wěn)定微管蛋白,抑制細(xì)胞的分裂和增殖。但由于它具有更好的水溶性、簡(jiǎn)單的化學(xué)結(jié)構(gòu),并且對(duì)紫杉醇的耐受細(xì)胞表現(xiàn)出很大活性以及不會(huì)象紫杉醇那樣產(chǎn)生內(nèi)毒素等的優(yōu)點(diǎn),激發(fā)了科研人員和制藥公司的極大熱情,成為化學(xué)界、生物界和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。在化學(xué)全合成、生物發(fā)酵、生物的合成改造、活性與構(gòu)象關(guān)系的推導(dǎo)、基因簇異源表達(dá)等方面取得了

2、卓越的成就。當(dāng)前已經(jīng)有5種埃博霉素類活性物進(jìn)入II期和III期臨床評(píng)估,作為新的第三代化療藥物走向市場(chǎng)指日可待。但作為埃博霉素的來(lái)源菌—纖維堆囊菌,因?yàn)閭鞔鷷r(shí)間長(zhǎng)、菌株特異性強(qiáng)、耐藥范圍廣、聚集生長(zhǎng)和可使用的分子標(biāo)記少等不利因素,使得對(duì)纖維堆囊菌基因操作極為困難,對(duì)埃博霉素合成的基因調(diào)控、操縱子的工作方式,轉(zhuǎn)錄的控速部分等問(wèn)題的認(rèn)知近于空白。除此之外,到目前為止人們還沒(méi)有在纖維堆囊菌乃至粘細(xì)菌中找到一個(gè)能自主復(fù)制,獨(dú)立于宿主細(xì)胞的質(zhì)粒。

3、以上種種原因成為限制對(duì)纖維堆囊菌所產(chǎn)生的豐富的、具有生物活性二級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究和利用的瓶頸。本文以埃博霉素的陽(yáng)性菌株——S.cellulosum So ce90為對(duì)象,研究了該菌株的發(fā)酵條件和純化的工藝流程,并通過(guò)利用廣譜可移動(dòng)質(zhì)粒pRK415構(gòu)建含有EpoPro片段(埃博霉素合成酶基因中epoA起始密碼子(GTG)上游(-890～-1bp)區(qū)域)和熒光蛋白基因的pRP-GFP載體,建立了針對(duì)該菌株的基因轉(zhuǎn)化體系。主要結(jié)論如下:①以高

4、效液相色譜為檢測(cè)手段,埃博霉素的產(chǎn)量為指標(biāo),比較9種不同培養(yǎng)基,篩選出適合S. cellulosum So ce90的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。適宜培養(yǎng)基(II號(hào)發(fā)酵液)的主要成分是:2g/L脫脂大豆粉,10g/L馬鈴薯淀粉,8g/L脫脂奶粉,2g/L酵母浸膏,2g/L葡萄糖,8 mg/L Na-FeIII-EDTA,1 g/L MgSO4·7H2O,1g/L CaCl2·2H2O,11.5g/L HEPES,2％(v/v)樹(shù)脂XAD-16。用

5、KOH調(diào)節(jié)pH值為7.4。最適種子培養(yǎng)液采用在30℃,180rpm培養(yǎng)4天得到的G52發(fā)酵液。以5%的接種量添加到II號(hào)發(fā)酵液中,發(fā)酵8天達(dá)到最高產(chǎn)率。②埃博霉素分離和純化工藝是首先采用100%異丙醇將埃博霉素從樹(shù)脂中洗脫出來(lái),通過(guò)乙酸乙脂和石油醚(1:1)的混合有機(jī)液進(jìn)行萃取后,SOURCETM30反相層析,最后利用C18反相半制備柱,高效液相制備得到埃博霉素A和B。經(jīng)質(zhì)譜,紫外光譜和紅外光譜等驗(yàn)證結(jié)構(gòu),與文獻(xiàn)報(bào)道一致。③利用結(jié)合轉(zhuǎn)移

6、的方式將載體pRP-GFP從E.coli S17-1中導(dǎo)入到S. cellulosum So ce90中,在四環(huán)素(50μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)的選擇壓力下篩選轉(zhuǎn)化子。對(duì)轉(zhuǎn)化子的Southern雜交證明該質(zhì)粒在宿主菌中并沒(méi)有被整合到宿主菌的基因組上。這是首次發(fā)現(xiàn)能在粘細(xì)菌中獨(dú)立存在且自主復(fù)制的質(zhì)粒。因此,此質(zhì)粒將為分離及分析埃博霉素代謝相關(guān)基因提供有力而便利的工具,從這個(gè)意義上說(shuō),這個(gè)質(zhì)粒的獲得是對(duì)S. cellulos

7、um So ce90的遺傳及分子生物學(xué)研究上取得的突破。④結(jié)合轉(zhuǎn)移的效率主要和融合時(shí)間相關(guān),而融合前的熱擊并不影響轉(zhuǎn)化率。最佳的融合時(shí)間是60-65h,轉(zhuǎn)移效率達(dá)到9×10-6。但是,當(dāng)融合時(shí)間高于70小時(shí)或低于40小時(shí),獲得轉(zhuǎn)化子極少。⑤轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)宿主細(xì)胞維持在有四環(huán)素的環(huán)境中時(shí),pRP-GFP能長(zhǎng)期存在,并且穩(wěn)定表達(dá);而在沒(méi)有抗生素的壓力下,子代中質(zhì)粒將出現(xiàn)嚴(yán)重的丟失,繁殖到50代的時(shí)候,細(xì)胞中質(zhì)粒的含有率僅僅達(dá)到73