保健食品中他達那非類藥物免疫檢測方法研究.pdf

1、他達那非作為第二代磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制劑，是一種治療男性勃起功能障礙的處方藥，經(jīng)常被非法添加到聲稱具有抗疲勞、增強免疫力、補腎壯陽等功能的保健食品中。但此類藥物與硝酸酯類藥物同時服用會引起低血壓，甚至死亡。因此，加強對此類藥物非法添加的監(jiān)控對保障食品安全至關重要。目前，此類藥物的檢測主要依賴于液相色譜、氣相色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用等大型儀器手段。但是，大型儀器分析方法檢測成本高、需要專業(yè)的操作人員、且不能進行現(xiàn)場監(jiān)控，難以普及，尤

2、其是在經(jīng)濟支持薄弱的基層單位。免疫分析法是運用抗原抗體反應與酶促反應相結(jié)合的一種快速、靈敏、低成本、易于現(xiàn)場操作的檢測技術，可與大型儀器確證技術形成互補，高低搭配，滿足大批量樣品的快速、篩查確證檢測需求。目前，有關PDE-5抑制劑他達那非類藥物的免疫檢測方法尚未見報道。因此，本文以他達那非為對象，開展半抗原/抗原設計合成、動物免疫及寬譜特異性抗體制備、間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法和膠體金免疫層析試紙條等研究。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：

3、　　（1）以氨基他達那非為原料設計合成出了5種半抗原 H1~H5，并通過偶聯(lián)載體蛋白進行動物免疫及抗血清的篩選，制備得到了2種高效的能夠特異性識別他達那非類藥物的抗體PAb-H5-AmTD-MA和PAb-H5-AmTD-MA-KLH，在1μg/mL他達那非藥物條件下，其抑制率分別為89％和95%。
　?。?）基于PAb-H5-AmTD-MA抗體建立了檢測他達那非類藥物的間接競爭酶聯(lián)免疫分析（ic-ELISA）方法。通過優(yōu)化確定了最

4、佳反應參數(shù)：包被原濃度為32.15 ng/mL，抗體稀釋倍數(shù)為8 k，藥物稀釋緩沖液為pH8.4的0.01 mol/L含0.2%吐溫-20的PBST，競爭反應時間為40 min，二抗反應時間為30 min，顯色時間為10 min，體系中甲醇濃度控制在5%以內(nèi)，建立了ic-ELISA方法，該方法對他達那非的檢測限（LOD）為0.027 ng/mL、IC50為0.90 ng/mL、線性范圍（IC20-IC80）為0.099~8.22 ng/

5、mL；保健酒、膠囊等固體和液體保健食品樣品中他達那非的平均添加回收率在84.92%~116.19%之間，變異系數(shù)在6.37%~14.28%之間，與 HPLC-MS/MS方法檢測結(jié)果相關性良好（R2=0.9993）。
　?。?）基于 PAb-H5-AmTD-MA-KLH抗體制備了檢測他達那非類藥物的膠體金免疫層析試紙條（GICA）。通過檸檬酸還原法燒制了~16nm的膠體金溶液，并優(yōu)化確定了最佳方法條件為：膠體金標記抗體時膠體金溶液

6、pH值為8.5、抗體用量為0.75μg/mL；金標抗體及包被原濃度均不稀釋最佳，此時金標抗體濃度為原始膠體金溶液的1/10，包被原濃度為1 mg/mL；最佳的樣品墊膜材質(zhì)為GF-06；樣品墊處理液為0.2 M pH7.5 Tris-HCl緩沖液；藥物稀釋液為0.01 M pH7.4的PBST，其甲醇含量最好不超過5%；質(zhì)控線二抗稀釋倍數(shù)為30倍，此時二抗?jié)舛葹?.27 mg/mL，進一步構建了定量分析GICA試紙條，對他達那非的檢測范圍

7、為0.71~141.99 ng/mL，IC50為10.04 ng/mL；保健酒、膠囊等固體和液體保健食品樣品中他達那非的平均回收率在93.34%~121.50%，平均變異系數(shù)在0.95%~13.33%，與HPLC-MS/MS方法檢測結(jié)果相關性良好（R2=0.9598）。
　?。?）采用以上兩種方法對保健酒類液體樣品及固體樣品盲樣進行檢測，發(fā)現(xiàn)9種保健酒中有3種檢測為陽性，13種固體樣品中有4種檢測出為陽性，且含量均在μg/mL以上