膽固醇-半乳糖苷配體修飾紫杉醇脂質(zhì)體的制備及其抑制HepG2腫瘤細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:
　　半乳糖受體是一種廣泛分布在哺乳動(dòng)物肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的受體，又被稱為去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR)，能夠應(yīng)用于構(gòu)建肝細(xì)胞特異性靶向脂質(zhì)體。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是紅豆杉中提取的四環(huán)二萜類化合物，是一種廣譜抗癌藥物;臨床研究表明對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷能力可與氟尿嘧啶相當(dāng)而副作用較小。探究紫杉醇納米制劑對(duì)肝癌的治療是目前紫杉醇研究開發(fā)的新目標(biāo)。本首先酶促合成膽固

2、醇-半乳糖苷，將其作為配體制備膽固醇-半乳糖苷修飾紫杉醇配體脂質(zhì)體，利用半乳糖配體的肝靶向性，使修飾物在肝臟富集，更有效地發(fā)揮紫杉醇抗肝癌的作用;同時(shí)，考察該配體脂質(zhì)體的處方、制備工藝、基本理化性質(zhì)和穩(wěn)定性，并且以紫杉醇注射液和普通紫杉醇脂質(zhì)體為參比制劑，對(duì)該配體脂質(zhì)體的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)、組織分布、體外的抑制腫瘤細(xì)胞活性進(jìn)行深入探討，為紫杉醇開發(fā)成抗肝癌新型靶向制劑提供理論支撐。
　　方法:
　　1.膽固醇-半乳糖苷的酶促合成

3、、分離純化、結(jié)構(gòu)表征及穩(wěn)定性考察
　　以吡啶∶丙酮(2∶1，v/v)混合溶劑作為溶媒，利用Novozym435固定化脂肪酶的催化，在一定溫度下，乳糖醇與膽固醇癸二酸二乙烯單酯酯化生成膽固醇-半乳糖苷配體。采用單因素考察分析各因素對(duì)該酶促酯化反應(yīng)的影響規(guī)律，Box-Behnken效應(yīng)面法設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化工藝參數(shù)。通過層析柱分離純化產(chǎn)物;建立膽固醇-半乳糖苷含量的HPLC分析方法;利用TLC、MS、IR、NMR等技術(shù)分析鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征

4、。通過影響因素、加速試驗(yàn)考察該配體的穩(wěn)定性。
　　2.膽固醇-半乳糖苷修飾的紫杉醇配體脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)研究
　　在脂質(zhì)材料中加入適當(dāng)比例(w％)的膽固醇-半乳糖苷，采用薄膜分散法，水化孵育、超聲、微孔濾膜過濾后，制備了紫杉醇配體脂質(zhì)體;通過單因素考察和正交設(shè)計(jì)法，優(yōu)選最佳處方，獲得質(zhì)優(yōu)、穩(wěn)定的脂質(zhì)體;考察紫杉醇配體脂質(zhì)體的外觀、粒徑、zeta電位、包封率。
　　3.紫杉醇配體脂質(zhì)體在SD大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)及KM

5、小鼠組織分布學(xué)研究
　　以紫杉醇(Paclitaxel，PTX)為目標(biāo)藥物，制備PTX-i普通注射液、PTX-L普通脂質(zhì)體和Gal-PTX-L配體脂質(zhì)體三種制劑;SD大鼠、KM小鼠作為動(dòng)物模型，通過尾靜脈注射方式給藥，分別考察這三種紫杉醇制劑在機(jī)體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以及在心、肝、脾、肺、腎等組織的分布;利用甲基叔丁基醚(MTBE)萃取法分離出血漿中的PTX，以多烯紫杉醇(Docetaxel，DOC)為內(nèi)標(biāo)物計(jì)算PTX血藥濃度;D

6、AS2.1軟件分析藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。
　　4.紫杉醇配體脂質(zhì)體的體外抗HepG2細(xì)胞活性研究
　　在體外抗腫瘤試驗(yàn)中，大量培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株，接種適量HepG2細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)分四組:陰性對(duì)照組、PTX注射液組、PTX-L組、Gal-PTX-L組，以給藥24-48-72h后，通過CCK(四唑單鈉鹽類)法和LDH(乳酸脫氫酶)法分別測(cè)定細(xì)胞存活率、三種含紫杉醇的藥物的IC50和細(xì)胞釋放的LDH活性(IU/L)

7、，進(jìn)而綜合評(píng)價(jià)該Gal-PTX-L制劑的抗腫瘤療效優(yōu)勢(shì)。
　　結(jié)果:
　　1.膽固醇-半乳糖苷的酶促合成、分離純化、結(jié)構(gòu)表征及穩(wěn)定性
　　利用酶法成功制備了膽固醇-半乳糖苷配體，考察了酶的種類、加酶量、反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)溫度、底物摩爾比、反應(yīng)時(shí)間等單因素對(duì)酶催化的影響，建立了Box-Behnken效應(yīng)面模型，獲得最優(yōu)反應(yīng)條件:乳糖醇(Lactitol，LA)與膽固醇癸二酸單烯酯(Cholesterylhemi-vinyl

8、sebacate，CHS-DD)摩爾比1∶3.7，Novozym43522.8mg，吡啶∶丙酮(2∶1，V/V)2.1mL，溫度55℃，反應(yīng)時(shí)間31.2h，該條件下產(chǎn)率可達(dá)94％以上。通過簡(jiǎn)單的柱層析流程，分離純化膽固醇-半乳糖苷配體分子。經(jīng)過TLC、MS、IR、NMR等技術(shù)，確證了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征。根據(jù)影響因素試驗(yàn)的結(jié)果，該配體的包裝應(yīng)密封，放置在干燥、陰涼、避光處。
　　2.膽固醇-半乳糖苷修飾的紫杉醇配體脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)

9、研究
　　以紫杉醇(PTX)為目標(biāo)藥物，制得PTX普通脂質(zhì)體、PTX半乳糖基化脂質(zhì)體。建立了脂質(zhì)體中包合的PTX的HPLC含量測(cè)定法，通過線性、專屬性、精密度、回收率、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察，證明該方法適用、可靠。選取藥脂比、磷脂與膽固醇比和膽固醇-半乳糖苷用量(w％)為考察對(duì)象，包封率(％)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化脂質(zhì)體制備工藝參數(shù)，獲得最佳工藝條件為:磷脂與藥物的質(zhì)量之比為4∶1，磷脂與膽固醇的質(zhì)量之比為5∶1，膽固醇-半乳糖

10、苷用量(w％)為8％。在最優(yōu)工藝下，制備三份樣品，顯示包封率86％以上，粒徑保持在160nm左右。
　　3.紫杉醇配體脂質(zhì)體在SD大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)及KM小鼠組織分布學(xué)研究
　　首先建立了血漿中PTX濃度的LC-MS/MS測(cè)定方法，通過方法學(xué)考察證明了該方法適用、可行;考察了血液樣品的萃取藥物方法，證實(shí)甲基叔丁基醚萃取效果更佳，符合分析的要求;三種制劑經(jīng)大鼠尾靜脈給藥（5mg/kg）后，半衰期T1/2z(h)分別是4.26

11、±0.72(PTX-i)，2.83±1.28(PTX-L)，3.32±2.05(Gal-PTX-L);表觀分布容積Vz(L/kg)分別是9.44±2.28(PTX-i)，3.89±1.03(PTX-L)，16.11±6.23(Gal-PTX-L);清除率CLz(L/h/kg)分別為1.46±0.17(PTX-i)，1.12±0.35(PTX-L)，4.06±1.55(Gal-PTX-L)。另外，經(jīng)小鼠尾靜脈給藥后，紫杉醇普通脂質(zhì)體、紫杉

12、醇配體脂質(zhì)體肝靶向參數(shù)Re分別是0.105和4.103;Te(％)為3.083和56.112;RTe為0.117和2.105;Ce為0.109和3.298。
　　4.紫杉醇配體脂質(zhì)體的體外抗HepG2細(xì)胞活性研究
　　在0.1μg/mL劑量下，PTX-i組、PTX-L組、Gal-PTX-L組的24h細(xì)胞存活率分別為:50.08％，26.25％和11.38％;48h細(xì)胞存活率各是:45.84％，32.25％和19.17％;72

13、h細(xì)胞存活率為:43.03％，28.45％和24.85％。另外，三組藥物的IC50分別是0.438μg/mL，0.121μg/mL和0.037μg/mL。藥物干預(yù)后三組藥物的培養(yǎng)液中24hLDH的活性分別是20.14IU/L，27.67IU/L和39.37IU/L;48hLDH的活性分別是34.60IU/L，51.74IU/L和65.11IU/L;72hLDH的活性分別為48.98IU/L，65.20IU/L和80.91IU/L。

14、>　　結(jié)論:
　　綜上所述，膽固醇-半乳糖苷的合成及其紫杉醇配體脂質(zhì)體的研究，提供了一種新穎、高效和穩(wěn)定的將半乳糖基化脂質(zhì)體藥物運(yùn)送至HepG2靶細(xì)胞并發(fā)揮抗腫瘤活性的途徑。通過藥物動(dòng)力學(xué)和組織分布研究，確認(rèn)了紫杉醇配體脂質(zhì)體比普通制劑具有更好的肝靶向性，更容易在肝臟蓄積;在體外抗肝腫瘤細(xì)胞研究中，表明紫杉醇配體脂質(zhì)體能夠發(fā)揮良好抑制肝腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的療效，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。因此，我們有理由相信紫杉醇配體脂質(zhì)體在肝