CpG-Au@HBc病毒樣顆粒的構(gòu)建及其跨膜機(jī)制和免疫刺激能力的研究.pdf

1、乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒(Hepatitis virus B virus core protein virus likeparticles，HBc VLPs)因其不具有乙肝病毒的復(fù)制能力而又具備較強(qiáng)的免疫原性而被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建新型疫苗。另一方面，HBc VLPs的正二十面體空腔結(jié)構(gòu)和解聚/自組裝特性使得其還能夠作為納米載體呈遞基因、納米粒子等。本課題利用HBc VLPsC末端的富集正電荷序列可以通過靜電吸引力與核酸相互作用的特點(diǎn)，構(gòu)建

2、了一種同時(shí)包裹有CpG寡核苷酸鏈(CpG ODNs)佐劑和金納米粒子的HBc VLPs，對(duì)其跨細(xì)胞膜機(jī)制和免疫刺激能力進(jìn)行了初步研究，具體工作如下:
　　1.構(gòu)建CpG-Au@HBc VLPs納米復(fù)合物:1）在原核表達(dá)系統(tǒng)（E.coli）內(nèi)誘導(dǎo)HBc VLPs蛋白的表達(dá)，采用鹽析和色譜柱分離的方法純化出較純的HBcVLPs蛋白;2）以“種子生長(zhǎng)法”和改良的Frens法合成出不同粒徑、尺寸較均一的納米金球(Au NSs)，通過加鹽老

3、化的方法在Au NSs表面接上巰基化的CpGODNs;探究了不同粒徑大小(5-15 nm)的Au NSs與巰基化CpG ODNs的連接效率，研究發(fā)現(xiàn)粒徑越小的Au NSs體系在與CpG ODNs連接過程中越穩(wěn)定，15nm Au NSs體系則較易聚沉;3）HBc VLPs蛋白解聚后能夠與CpG-Au NPs因靜電相互作用結(jié)合并實(shí)現(xiàn)包封，形成殼核結(jié)構(gòu)的CpG-Au@HBc VLPs納米復(fù)合物。
　　2.通過MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)CpG-Au@H

4、Bc VLPs納米復(fù)合物的細(xì)胞生物相容性進(jìn)行了評(píng)價(jià);利用流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了CpG-Au@HBc VLPs能夠有效進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞，同時(shí)結(jié)合幾種不同的胞吞途徑特異抑制劑確定了其跨膜進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制;此外，利用相差顯微鏡觀察了CpG-Au@HBc VLPs對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。
　　3.建立小鼠免疫實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究CpG-Au@HBc VLPs納米復(fù)合物的免疫刺激能力，結(jié)果顯示:1）細(xì)胞免疫應(yīng)答能力強(qiáng):小鼠脾細(xì)胞中CD4+、CD8+T細(xì)

5、胞表達(dá)量及Th1型細(xì)胞因子IFN-γ分泌量明顯高于其它組（HBc VLPs組、CpG@HBc VLPs組及弗氏佐劑與HBc VLPs聯(lián)用組）;2）能引發(fā)中等程度的體液免疫應(yīng)答:小鼠血清中抗HBc抗體滴度及Th2型細(xì)胞因子IL-4分泌量高于HBcVLPs組和CpG@HBc VLPs組，達(dá)到傳統(tǒng)弗氏佐劑（強(qiáng)體液免疫誘導(dǎo)佐劑）與HBc VLPs聯(lián)用組的一半以上;3）Au NPs在促進(jìn)整個(gè)復(fù)合物的體液和細(xì)胞免疫刺激效果中都發(fā)揮了作用（與CpG@