CpG寡核苷酸免疫刺激DNA序列的構(gòu)效關系分析及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、作為免疫刺激序列(immunostimulatory sequence，ISS)，含有非甲基化CpG二核苷酸的寡脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotides，ODN)能直接激活B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、抗原遞呈細胞等；間接激活T細胞、NK細胞；誘導以Th1型為主的免疫應答，是一種高效低毒的免疫佐劑。在腫瘤、免疫缺陷性疾病、感染性疾病及過敏性疾病治療中有著強大的潛在應用價值，CpG ODN作為一種新型的免疫刺激劑越來越多地受

2、到人們的關注。 CpG ODN的免疫刺激活性具有結(jié)構(gòu)特異性，其免疫刺激活性與結(jié)構(gòu)之間的相關關系仍有許多環(huán)節(jié)尚待闡明：游離的5’端結(jié)構(gòu)是否免疫刺激活性所必需?回文結(jié)構(gòu)的有無、多寡、堿基構(gòu)成特征及其在序列中的位置對活性有無影響?此外，CpG基序在序列中的數(shù)量、距離遠近、空間連接、5’端的堿基組成對ISS免疫刺激活性的影響也均有待系統(tǒng)研究。 CpG ODN的免疫刺激作用具有種屬特異性，我們選擇已知有效的小鼠特異性ISS——OD

3、Nl826為模板和陽性對照，設計了一系列不同結(jié)構(gòu)的CpG ODNs，采用多種生物學方法對所設計CpG ODNs的免疫活性進行檢測，并基于此進行構(gòu)效關系分析，總結(jié)一些能夠揭示CpG ODN免疫刺激作用機制的新規(guī)律，并對新型CpGODN的理性設計提供理論和實驗依據(jù)。 研究中篩選出了若干條免疫刺激活性優(yōu)于陽性對照ODN1826的ISS，對這些CpG ODN在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性以及對荷瘤鼠免疫調(diào)節(jié)機能的影響進行了系統(tǒng)的分析。此外，對C

4、pG ODN免疫刺激活性的分子機制進行了初步研究。 一、以小鼠特異性的B型CpG ODNl826為模板和陽性對照，設計了15條CpGODNs(ODNl～ODN 5)，涉及到CpG基序在序列中的數(shù)量、距離遠近、空間連接，5’端的堿基組成，回文結(jié)構(gòu)的有無、回文結(jié)構(gòu)堿基構(gòu)成特征及其在序列中的位置等結(jié)構(gòu)變化；所設計CpG ODNs作用于小鼠脾細胞，以其對細胞因子IL-6、IL-12及IFNa等分泌的影響、對B細胞增殖活性、NK細胞殺傷活

5、性的影響等為活性指標，系統(tǒng)分析CpG ODNs的構(gòu)效關系。結(jié)果表明：1)最佳的CpG六堿基作用基序是5’-TCGACGTT-3’，與文獻報道一致；2)CpG島缺乏兩側(cè)翼的雙堿基將失去其免疫調(diào)節(jié)作用，如ODNl 5；3)CpG基序的數(shù)目最佳為2個，增加六堿基CpG基序數(shù)量(如ODN9)不增加其免疫刺激活性；4)相鄰兩個CpG基序之間的最適距離為3個堿基，距離的縮短(ODN5)或延長(ODN6)均會減弱CpG ODN的免疫刺激作用；5)5’

6、端TpC二堿基對于CpG ODN的免疫刺激活性很重要，去掉5’端TpC二堿基會使免疫刺激活性明顯減弱，如ODN6、ODN8；6)自身互補的回文結(jié)構(gòu)對于CpG ODN的免疫刺激作用很重要，如ODN4、ODN7、ODN10和ODN11；7)回文結(jié)構(gòu)在序列中的位置對活性有顯著影響：3’端回文結(jié)構(gòu)可增強序列的免疫刺激活性，而5’端回文結(jié)構(gòu)可導致CpG ODN免疫刺激活性幾乎消失，女IODN3、ODN12。值得注意的是，作為全回文結(jié)構(gòu)的ODN10

7、具有較強的免疫刺激活性，其回文結(jié)構(gòu)中包含完整的CpG作用基序5’-TCGACGTT-3’，如果不包含完整的CpG作用基序，僅以重復的CpG組成的自身互補的全回文結(jié)構(gòu)幾乎沒有免疫刺激活性，女IODNl5。 二、采用流式細胞術(shù)檢測不同結(jié)構(gòu)的CpG ODNsk寸特定的免疫細胞B細胞、DC細胞以及NK細胞的激活功能。將所設計CpG ODN與小鼠脾細胞共孵育，然后用流式細胞術(shù)檢測DC細胞、B細胞以及NK細胞亞群表面分子表達情況，系統(tǒng)分析C

8、pGODN結(jié)構(gòu)與其對各種免疫細胞活化能力的關系。研究結(jié)果顯示與前述構(gòu)效關系分析結(jié)論一致。 三、CpG ODNs體外抗鼠源性黑色素瘤活性研究。結(jié)果表明，經(jīng)CpGODN(ODN1-11)處理的小鼠脾細胞對小鼠黑色素瘤均表現(xiàn)不同程度的殺傷活性，不含CpG島的ODN沒有腫瘤殺傷活性；ODN4，ODN7，ODN10和IODN11的抗黑色素瘤活性明顯高于陽性對照ODN1826組(P<0.05)。 四、在構(gòu)效關系分析以及體外抗鼠源性黑

9、色素瘤活性研究的基礎上，選擇CpGODN的有效序列(ODN1826，ODN4，ODN7，0DN10和ODN11)進行小鼠體內(nèi)外抗腫瘤活性研究。研究發(fā)現(xiàn)，CpG ODN能不同程度延長荷黑色素瘤小鼠的生存時間，與陽性對照ODNl826比較，ODN4、ODN7和ODN11均表現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制作用(P<0.05)，ODNlO的作用尤為明顯(P<0.01)，抑瘤率達到(55．2±2．3)﹪。腫瘤組織切片H&E染色顯示，CpG ODN用藥組可觀察

10、到腫瘤細胞出現(xiàn)核空化、核水腫以及凋亡現(xiàn)象，而核膜清晰可見，這種現(xiàn)象在腫瘤病理中較少見，其機理尚待闡明；腫瘤組織免疫組化分析顯示，代表增殖活性的核抗原PCNA表達降低，表明腫瘤細胞增殖受到抑制；黑色素瘤細胞轉(zhuǎn)移相關的抗原CD63表達降低，表明瘤細胞轉(zhuǎn)移受到抑制。脾臟組織切片H&E染色顯示，PBS組荷瘤鼠的脾臟出現(xiàn)大面積壞死，梗死的脾血管內(nèi)可見壞死的腫瘤細胞團，而CpG ODN治療組未見瘤細胞轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)病理切片顯示，PBS組荷瘤鼠的淋巴結(jié)

11、中出現(xiàn)淋巴導管梗阻，內(nèi)可見轉(zhuǎn)移的瘤細胞團塊，而CpG ODN治療組未見瘤細胞轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果說明：CpG ODN不僅能夠抑制腫瘤細胞的生長，而且能夠抑制腫瘤細胞在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和浸潤。 五、CpG ODN對荷瘤鼠模型體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機能的影響。研究發(fā)現(xiàn)，C57 BL/6小鼠荷黑色素瘤后，血清中IL-12的含量顯著降低，IgE的含量急劇上升，脾臟中B細胞、T細胞的增殖活性以及NK細胞的殺傷活性均明顯下降，腹腔巨噬細胞的吞噬功能也明顯

12、減弱，提示腫瘤能夠促使免疫系統(tǒng)Th1/Th2平衡向TH2漂移，使機體的抗腫瘤免疫效應大大減弱。而CpG ODN能誘導荷瘤鼠產(chǎn)生大量的IL-12，抑制IgE的產(chǎn)生，脾臟中B細胞、T細胞的增殖活性以及NK細胞的殺傷活性均顯著增強，巨噬細胞的吞噬功能也顯著增強，并且，腫瘤抑制效應越強CpG ODN所具有的免疫增強效應也越強，這兩種效應呈現(xiàn)正相關，這強烈提示CpG ODN能夠促使Th2型免疫應答向Thl型逆轉(zhuǎn)，扭轉(zhuǎn)因荷瘤導致的機體免疫功能低下，

13、從而增強機體的抗腫瘤免疫效應。另外，CpG ODN各組荷瘤鼠均出現(xiàn)不同程度的巨脾現(xiàn)象，病理切片顯示，脾臟紅、白髓邊界清晰，可見脾竇輕度充血，未見病理改變；淋巴結(jié)的病理切片顯示，CpG ODN治療組淋巴結(jié)中淋巴小結(jié)清晰可辨，淋巴細胞數(shù)量豐富，淋巴竇擴張；治療組腫瘤組織免疫組化分析顯示，腫瘤細胞表面共刺激分子CD80的表達增強，以上結(jié)果充分說明機體的抗腫瘤免疫效應增強。實驗數(shù)據(jù)顯示，ODN4，ODN7和ODN11的抗腫瘤免疫效應均高于陽性對

14、照ODN1826(P<0.05)，而具有全回文結(jié)構(gòu)的ODN10作用尤為明顯(P<0.01)。 六、為進一步探討CpG ODN免疫刺激活性的機理，檢測了不同結(jié)構(gòu)的CpGODN(ODN1826，ODNlO和ODN11)對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP1的轉(zhuǎn)錄活性影響，同時檢測了上述不同結(jié)構(gòu)的CpG ODN與TLR9的結(jié)合活性。CpG ODN通過TLR9介導的多種信號轉(zhuǎn)導途徑來調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子的表達，如NF-κB、AP1等，從而進一步調(diào)節(jié)免

15、疫相關的多種細胞因子的表達，最終實現(xiàn)CpG ODN的免疫調(diào)節(jié)功能。EMSA實驗結(jié)果表明，不同結(jié)構(gòu)的CpG ODN能不同程度地上調(diào)NF-κB及AP1的轉(zhuǎn)錄活性，ODN10能誘導NF-κB的表達，但其作用低于ODN1826或ODN10；但ODN10誘導AP1的活性高于ODN1826或ODN10，前面提到的ODN10促使IL-12的高表達可能與其對AP1的高轉(zhuǎn)錄活性有關。TLR9是介導CpG ODN實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)活性的重要受體，我們將ODN18

16、26，ODN10和ODN11進行5’端生物素標記，然后分別與TLR9結(jié)合，發(fā)現(xiàn)三種結(jié)構(gòu)的CpG ODN均能與TLR9結(jié)合，表明5’端被生物素封閉后仍然可以與TLR9結(jié)合，這與先前許多報道CpG ODN與TLR9的識別是從5’端到3’端依次進行的，CpG ODN 5’端的游離很重要的說法不一致。這提示我們，除了TLR9之外，CpG ODN可能還需要結(jié)合另一種未知的相關受體，其結(jié)合需要CpG ODN 5’端的游離。另外，EMSA實驗結(jié)果顯示