Aβ多肽的T細胞免疫刺激抑制研究及人源抗體基因真核表達體系的構(gòu)建.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)是以記憶力減退、認知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，是老年人中常見的一種癡呆癥。主要的病理學特征包括腦內(nèi)的細胞外β—淀粉樣多肽(β—amyloidpeptide，Aβ)的沉積導致的老年斑、細胞內(nèi)過度磷酸化tau蛋白導致的神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元細胞的缺失營養(yǎng)壞死。 近年來的研究充分表明，無論是采用Aβ作為抗原的主動免疫刺激或者直接注射抗Aβ抗體，都不但可以減少和阻抑AD

2、轉(zhuǎn)基因鼠中Aβ的沉積，還可以明顯改善實驗鼠的行為及認知障礙。目前免疫治療已經(jīng)成為治療AD的重要途徑，并取得了很大進展。 AD主動免疫治療臨床Ⅱ期研究中發(fā)現(xiàn)Aβ免疫后6％的患者大腦出現(xiàn)腦炎反應(yīng)的毒副作用。目前導致腦膜腦炎的具體原因尚不清楚，但相關(guān)研究提示腦炎的發(fā)生可能是T淋巴細胞介導的自身免疫反應(yīng)的結(jié)果，與免疫引起的T淋巴細胞亞型(Thelpercell1/Thelpercell2，Th1/Th2)的平衡有關(guān)，如能降低或抑制Th1

3、反應(yīng)、增強Th2的反應(yīng)，將增加AD免疫治療的安全性。 目前被動免疫研究結(jié)果大都是用單克隆抗體在動物試驗中得到的，雜交瘤技術(shù)制備的單抗多為鼠源性，對于人體來說屬于異種蛋白，且其不能有效地活化補體和Fc受體相關(guān)的效應(yīng)系統(tǒng)，進一步的研究需要將鼠源抗體轉(zhuǎn)換成人源化的抗體才能應(yīng)用于人體，但這種方法技術(shù)復雜難度高，即使改造后也難以得到百分之百的人源化，且有可能在改造過程中使原來抗體的親和力和特異性降低。 針對AD免疫學治療中存在的問

4、題，本課題在上述兩個方面進行了初步探討。 本課題第一部分利用不同的Aβ多肽序列與佐劑的組合，觀察體液免疫和細胞免疫的水平高低，通過細胞因子的測定分析佐劑、抗原的序列長短及T細胞刺激表位這三種因素引起的T淋巴細胞亞型的不同刺激和影響，探討導致免疫毒性反應(yīng)的具體因素和抑制途徑。將BALB/c小鼠隨機分組：鋁(Al)佐劑對照組、Aβ42+福氏佐劑(CFA)組、Aβ42+Al組、Aβ40+Al組、Aβ40(E22A)+Al組，每組8只。

5、經(jīng)初次免疫和3次加強免疫后，檢測抗體效價，培養(yǎng)脾淋巴細胞，分別用各自抗原刺激，48h后用雙抗夾心ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)液中IFN—γ、IL—2、TNF-α和IL—4的含量。72h后用CCK—8法檢測脾淋巴細胞特異性增殖反應(yīng)。結(jié)果表明，經(jīng)Aβ免疫的4個試驗組血清中均有特異性抗Aβ的抗體產(chǎn)生。脾淋巴細胞經(jīng)各自抗原刺激后，均出現(xiàn)脾淋巴細胞特異性增殖反應(yīng)。細胞培養(yǎng)上清中細胞因子檢測結(jié)果顯示，Aβ42+CFA組分泌的代表Th1型的細胞因子含量最

6、高，Ap40(E22A)+Al組則有顯著降低(P<0.01)。其中Aβ40及突變型+Al組與Aβ42+Al組相比，分泌的Th1型細胞因子也有明顯降低(P<0.05)。因此Aβ40(E22A)+Al組對T細胞的毒性作用最低，在機體的免疫反應(yīng)中可能具有更好的安全性。 本課題第二部分研究內(nèi)容為抗Aβ人源抗體基因真核表達體系的構(gòu)建。本室利用噬菌體展示技術(shù)篩選得到了抗Aβ的抗體，通過篩選直接得到人源抗體，避免了對通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體的

7、人源化改造過程。首先將scFv抗體基因與合適的信號肽基因及人IgG抗體恒定區(qū)基因重組，構(gòu)建成全抗體基因表達體系，以增加抗體穩(wěn)定性、延長半衰期、提高抗體性能。為了提高抗體的安全性，還將抗體基因的Fc段的3個重要位點進行突變，以期減少T細胞反應(yīng)和少腦部的微血管出血反應(yīng)。最后選用真核表達載體pcDNA3.1，將目的基因連入真核表達載體中，輕重鏈做共轉(zhuǎn)染COS—7、CHO真核細胞表達，但是目前沒有檢測到抗體基因在COS—7及CHO中的表達，沒有

8、表達的原因可能與抗體基因的可變區(qū)序列及親和力有關(guān)。 Ap疫苗及抗體的安全性問題是當今AD免疫治療的關(guān)鍵問題之一。本課題一方面從探討降低免疫反應(yīng)的T細胞毒性作用的途徑和增加抗原抗體反應(yīng)的人體安全性適應(yīng)性入手，另一方面構(gòu)建了抗Aβ人源抗體基因的真核表達體系，在AD的主動免疫和被動免疫兩方面做了探索研究。今后，如果能篩選出適宜的抗原及佐劑的組合，使Th細胞發(fā)生向Th2的極化，那么極有可能避免臨床試驗中出現(xiàn)的腦膜腦炎不良反應(yīng)的問題，為A